एक्सोसाइटोसिस का स्वचालित पता लगाना और विश्लेषण
Summary
हमने पीएच-संवेदनशील फ्लोरोसेंट जांच द्वारा चिह्नित एक्सोसाइटिक घटनाओं का पता लगाने के लिए स्वचालित कंप्यूटर विजन सॉफ्टवेयर विकसित किया है। यहां, हम संलयन घटनाओं का पता लगाने, संलयन के स्थानिक मापदंडों का विश्लेषण और प्रदर्शन करने और घटनाओं को अलग-अलग संलयन मोड में वर्गीकृत करने के लिए एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस और आरएसट्यूडियो के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं।
Abstract
वेसिकल स्नेक प्रोटीन से जुड़े पीएच-सेंसिटिव जीएफपी (पीएचलूरिन) की टाइमलैप्स टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी सेल कल्चर में सिंगल वेसिकल एक्सोसाइटिक घटनाओं की कल्पना करने के लिए एक प्रभावी तरीका है। ऐसी घटनाओं के निष्पक्ष, कुशल पहचान और विश्लेषण करने के लिए, मैटलैब में कंप्यूटर-दृष्टि आधारित दृष्टिकोण विकसित और लागू किया गया था। विश्लेषण पाइपलाइन में सेल सेगमेंटेशन और एक्सोसाइटिक-इवेंट आइडेंटिफिकेशन एल्गोरिदम होता है। कंप्यूटर-दृष्टि दृष्टिकोण में एकल घटनाओं के कई मापदंडों की जांच करने के लिए उपकरण शामिल हैं, जिनमें फ्लोरेसेंस क्षय और पीक बीएफ/एफ के आधे जीवन के साथ-साथ एक्सोसाइटोसिस की आवृत्ति का संपूर्ण-कोशिका विश्लेषण शामिल है। इन और संलयन के अन्य मापदंडों का उपयोग अलग-अलग संलयन मोड को अलग करने के लिए वर्गीकरण दृष्टिकोण में किया जाता है। यहां एक नवनिर्मित जीयूआई शुरू से खत्म करने के लिए विश्लेषण पाइपलाइन करता है । आर स्टूडियो में रिप्ले के कश्मीर फ़ंक्शन के आगे अनुकूलन का उपयोग अंतरिक्ष और समय दोनों में संलयन घटनाओं के क्लस्टर, फैलाया, या यादृच्छिक घटना के बीच अंतर करने के लिए किया जाता है।
Introduction
VAMP-pHluorin निर्माण या ट्रांसफरिन रिसेप्टर (TfR)- pHuji निर्माण एक्सोसाइटिक घटनाओं के उत्कृष्ट मार्कर हैं, क्योंकि इन पीएच-संवेदनशील फ्लोरोफोरस को एसिड वेसिकल ल्यूमेन के भीतर बुझाया जाता है और वेसिकल और प्लाज्मा झिल्ली1के बीच संलयन ताकना खोलने पर तुरंत फ्लोरोरेस होता है। संलयन ताकना खोलने के बाद, फ्लोरेसेंस तेजी से क्षय, कुछ विषमता है कि संलयन घटना के बारे में जानकारी का पता चलता है के साथ । यहां, एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) एप्लिकेशन का वर्णन किया गया है जो स्वचालित रूप से एक्सोसाइटिक घटनाओं का पता लगाता है और विश्लेषण करता है। यह एप्लिकेशन उपयोगकर्ता को पीएच संवेदनशील मार्कर2 द्वारा प्रकट एक्सोसाइटिक घटनाओं का स्वचालित रूप से पता लगाने और प्रत्येक घटना से सुविधाओं को उत्पन्न करने की अनुमति देता है जिसका उपयोग वर्गीकरण उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है3 (चित्रा 1A)। इसके अलावा, रिप्ले के के फ़ंक्शन का उपयोग करके एक्सोसाइटिक इवेंट क्लस्टरिंग का विश्लेषण वर्णित किया गया है।
एक्सोसाइटिक घटनाओं के विभिन्न एक्सोसाइटिक मोड में स्वचालित वर्गीकरण हाल ही में3बताया गया था । एक्सोसाइटोसिस के दो तरीके, फुल वेसिकल फ्यूजन (एफवीएफ) और चुंबन-एंड-रन फ्यूजन (केएनआर) एक्सोसाइटोसिस को पहले4,5,6,7बताया गया है । एफवीएफ के दौरान, फ्यूजन पोर फैलता है, और वेसिकल को प्लाज्मा झिल्ली में शामिल किया जाता है। केएनआर के दौरान, संलयन पोर क्षणिक रूप से खुलता है और फिर4,5,8,9,10को फिर से खोलता है। न्यूरॉन्स के विकास में एक्सोसाइटोसिस के चार तरीकों की पहचान की गई, दो एफवीएफ से संबंधित और दो केएनआर से संबंधित थे । यह काम दर्शाता है कि एफवीएफ और केएनआर दोनों को संलयन घटनाओं में आगे बढ़ाया जा सकता है जो फ्यूजन पोर खोलने या एक्सोसाइटिक घटनाओं के बाद फ्लोरेसेंस क्षय (एफवीएफआई और केएनआरआई) के लिए तुरंत आगे बढ़ते हैं जो फ्लोरेसेंस क्षय शुरू होने से पहले फ्यूजन पोर खोलने के बाद देरी का प्रदर्शन करते हैं (एफवीएफडी और केएनआरडी)(चित्रा 1 बी)। क्लासिफायर प्रत्येक संलयन घटना के लिए एक्सोसाइटोसिस की विधा की पहचान करता है। यहां इस विश्लेषण को एक जीयूआई में शामिल किया गया है जिसे विंडोज और मैक आधारित ऑपरेटिंग सिस्टम में मैटलैब में स्थापित किया जा सकता है। सभी विश्लेषण फ़ाइलें https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing पर पाई जा सकती हैं या
https://github.com/GuptonLab।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक्सोसाइटिक डिटेक्शन और एनालिसिस सॉफ्टवेयर का उपयोग करते समय, कृपया विचार करें कि कार्यक्रम केवल इनपुट के रूप में हानिरहित संपीड़न .tif फ़ाइलों को स्वीकार करता है। .tif इमेज फ़ाइलें 8-बिट, 16-बिट, या 32-बिट ग्र?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम परीक्षण कोड और जीयूआई के लिए डस्टिन रेवेल और रेजिनाल्ड एडवर्ड्स का शुक्रिया अदा करते हैं। वित्त पोषण स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा प्रदान की गई थी इस अनुसंधान का समर्थन: R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG), और F31NS103586 (फ्लू) सहित ।
Materials
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
Referências
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