Rilevamento e analisi automatizzati dell'esocitosi
Summary
Abbiamo sviluppato un software automatizzato di visione artificiale per rilevare eventi esocitici contrassegnati da sonde fluorescenti sensibili al pH. Qui, dimostriamo l’uso di un’interfaccia utente grafica e RStudio per rilevare eventi di fusione, analizzare e visualizzare i parametri spaziotemporali di fusione e classificare gli eventi in modalità di fusione distinte.
Abstract
La microscopia TIRF timelapse di GFP pH-sensibile (pHluorin) attaccata alle proteine SNARE delle vescicole è un metodo efficace per visualizzare gli eventi esocitici delle singole vescicole in coltura cellulare. Per eseguire un’identificazione e un’analisi imparziali ed efficienti di tali eventi, è stato sviluppato e implementato in MATLAB un approccio basato sulla visione artificiale. La pipeline di analisi è costituita da una segmentazione cellulare e da un algoritmo di identificazione degli eventi esocitici. L’approccio di visione artificiale include strumenti per lo studio di più parametri di singoli eventi, tra cui l’emivita del decadimento di fluorescenza e il picco ΔF / F, nonché l’analisi a cellule intere della frequenza dell’esocitosi. Questi e altri parametri di fusione sono utilizzati in un approccio di classificazione per distinguere modalità di fusione distinte. Qui una GUI di nuova costruzione esegue la pipeline di analisi dall’inizio alla fine. Un ulteriore adattamento della funzione K di Ripley in R Studio viene utilizzato per distinguere tra evento di fusione raggruppato, disperso o casuale sia nello spazio che nel tempo.
Introduction
I costrutti VAMP-pHluorin o i costrutti del recettore della transferrina (TfR)-pHuji sono eccellenti marcatori di eventi esocitici, poiché questi fluorofori sensibili al pH vengono spenti all’interno del lume della vescicola acida e fluoresceno immediatamente dopo l’apertura del poro di fusione tra la vescicola e la membrana plasmatica1. Dopo l’apertura dei pori di fusione, la fluorescenza decade in modo esponenziale, con una certa eterogeneità che rivela informazioni sull’evento di fusione. Qui viene descritta un’applicazione di interfaccia utente grafica (GUI) che rileva e analizza automaticamente gli eventi esocitici. Questa applicazione consente all’utente di rilevare automaticamente gli eventi esocitici rivelati dai marcatori sensibili al pH2 e generare caratteristiche da ciascun evento che possono essere utilizzate ai fini della classificazione3 (Figura 1A). Inoltre, viene descritta l’analisi del clustering di eventi esocitici utilizzando la funzione K di Ripley.
La classificazione automatizzata degli eventi esocitici in diverse modalità esocitiche è stata recentemente riportata3. Due modi di esocitosi, fusione completa vescicolare (FVF) ed esocitosi da fusione kiss-and-run (KNR) sono stati precedentemente descritti4,5,6,7. Durante la fecondazione in vitro, il poro di fusione si dilata e la vescicola viene incorporata nella membrana plasmatica. Durante KNR, il poro di fusione si apre transitoriamente e poi risigilla4,5,8,9,10. Sono state identificate quattro modalità di esocitosi nello sviluppo dei neuroni, due relative alla FVF e due correlate alla KNR. Questo lavoro dimostra che sia FVF che KNR possono essere ulteriormente suddivisi in eventi di fusione che procedono immediatamente al decadimento della fluorescenza (FVFi e KNRi) dopo l’apertura dei pori di fusione o eventi esocitici che mostrano un ritardo dopo l’apertura dei pori di fusione prima dell’inizio del decadimento della fluorescenza (FVFd e KNRd) (Figura 1B). Il classificatore identifica la modalità di esocitosi per ogni evento di fusione. Qui questa analisi è stata incorporata in una GUI che può essere installata in MATLAB in sistemi operativi basati su Windows e Mac. Tutti i file di analisi sono disponibili all’https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing o
https://github.com/GuptonLab.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quando si utilizza il software di rilevamento e analisi esocitica, si prega di considerare che il programma accetta solo la compressione senza perdita di dati .tif file come input. I file di immagine .tif possono essere immagini in scala di grigi (canale singolo) a 8 bit, 16 bit o a 32 bit. Altri formati di immagine devono essere convertiti in uno di questi tipi prima dell’input. Per riferimento, gli esempi utilizzati qui sono immagini in scala di grigi a 16 bit.
Inerenti al processo di rileva…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Dustin Revell e Reginald Edwards per aver testato il codice e la GUI. Il finanziamento è stato fornito dal National Institutes of Health ha sostenuto questa ricerca: tra cui R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) e F31NS103586 (FLU).
Materials
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
Referências
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
