エキソサイトーシスの自動検出と解析
Summary
pH感受性蛍光プローブでマークされたエキソキシティックイベントを検出する自動コンピュータビジョンソフトウェアを開発しました。ここでは、グラフィカルユーザーインターフェースとRStudioを使用して、融合イベントの検出、融合の時空間的パラメータの分析と表示、およびイベントを個別の融合モードに分類する方法を示します。
Abstract
小胞SNAREタンパク質に結合したpH感受性GFP(pHluorin)のタイムラプスTIRF顕微鏡は、細胞培養における単一の小胞性エキサイトイベントを可視化する有効な方法である。このような事象の公平で効率的な同定と分析を行うために、MATLABでコンピュータビジョンベースのアプローチが開発され、実装されました。分析パイプラインは、細胞セグメンテーションとexocytic-イベント識別アルゴリズムで構成されています。コンピュータビジョンアプローチには、蛍光減衰の半減期およびΔF/Fピークを含む単一事象の複数のパラメータを調査するためのツールと、エキソサイトーシスの頻度の全細胞分析が含まれる。これらの融合のパラメータと他のパラメータは、異なる融合モードを区別する分類アプローチで使用されます。ここで新しく構築された GUI は、最初から最後まで分析パイプラインを実行します。R StudioでのリプリーのK関数のさらなる適応は、空間と時間の両方でクラスター化、分散、またはランダムな核融合事象の発生を区別するために使用されます。
Introduction
VAMP-pフルオリン構築物またはトランスフェリン受容体(TfR)-pHuji構築物は、側耳球菌の優れたマーカーであり、これらのpH感受性フルオロフォアは、小胞と形質膜1との間の融合孔口開口の直後に酸性小胞腔および蛍光の中で直ちに消光される。融合孔の開口部に続いて、蛍光は指数関数的に崩壊し、融合事象に関する情報を明らかにするいくつかの異質性がある。ここでは、exocytic イベントを自動的に検出して分析するグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) アプリケーションについて説明します。このアプリケーションは、pH感受性マーカー2によって明らかにされたexocyticイベントを自動的に検出し、分類目的3(図1A)に使用できる各イベントから特徴を生成することをユーザーに可能にする。また、リプリーのK関数を用いたエキサイトティックイベントクラスタリングの解析も説明する。
異なるエキソサイトモードへのエキサイトティックイベントの自動分類は最近報告されました 3.2つの排泄物症のモード、フルベシクル融合(FVF)およびキスアンドラン融合(KNR)のエキソサイトーシスは、以前に4、5、6、7を説明した。FVFの間に、融合細孔は拡張し、そして小胞は、形質膜に組み込まれる。KNRの間に、融合孔は一時的に開き、4、5、8、9、10を再シールする。神経細胞化の4つのモードは、FVFに関連する2つ、KNRに関連する2つのニューロンの発達において同定された。この研究は、FVFとKNRの両方が、蛍光崩壊が始まる前に融解孔開口部または興奮性事象の後に直ちに蛍光減衰(FVFiおよびKNRi)に進む融合事象にさらに細分化できることを示している(図1B)。分類子は、各フュージョン イベントの exocytosis のモードを識別します。ここでは、この分析は、WindowsおよびMacベースのオペレーティングシステムでMATLABにインストールすることができるGUIに組み込まれています。すべての解析ファイルは、https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing または
https://github.com/GuptonLab。
Protocol
Representative Results
Discussion
exocytic検出および解析ソフトウェアを使用する場合、プログラムは入力としてファイル.tif可逆圧縮のみを受け入れることを考慮してください。.tifイメージ ファイルは、8 ビット、16 ビット、または 32 ビットのグレースケール (単一チャネル) イメージです。他の画像形式は、入力前にこれらのタイプのいずれかに変換する必要があります。参考として、ここで使用する例は 16 ビットのグレー…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
コードと GUI のテストに関して、Dustin Revell とレジナルド・エドワーズに感謝します。資金は、R01NS112326(SLG)、R35GM135160(SLG)、F31NS103586(FLU)を含む、この研究を支援する国立衛生研究所によって提供されました。
Materials
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
Referências
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
