Detecção e Análise Automatizada de Exocistose
Summary
Desenvolvemos um software automatizado de visão computacional para detectar eventos exocióticos marcados por sondas fluorescentes sensíveis ao pH. Aqui, demonstramos o uso de uma interface gráfica de usuário e RStudio para detectar eventos de fusão, analisar e exibir parâmetros espátulais de fusão e classificar eventos em modos de fusão distintos.
Abstract
A microscopia timelapse TIRF de GFP sensível ao pH (pHluorin) anexada às proteínas SNARE vesículas é um método eficaz para visualizar eventos exocióticos vesículas únicos na cultura celular. Para realizar uma identificação e análise imparcial e eficiente de tais eventos, uma abordagem baseada em visão computacional foi desenvolvida e implementada no MATLAB. O pipeline de análise consiste em um algoritmo de segmentação celular e identificação de eventos exocióticos. A abordagem da visão computacional inclui ferramentas para investigar múltiplos parâmetros de eventos únicos, incluindo a meia-vida da decadência da fluorescência e do pico ΔF/F, bem como a análise de células inteiras da frequência da exocitese. Estes e outros parâmetros de fusão são usados em uma abordagem de classificação para distinguir modos de fusão distintos. Aqui uma GUI recém-construída realiza o pipeline de análise do início ao fim. Uma adaptação adicional da função K de Ripley no R Studio é usada para distinguir entre eventos de fusão agrupados, dispersos ou aleatórios no espaço e no tempo.
Introduction
Construções VAMP-pHluorin ou receptor de transferrina (TfR)-pHuji construções são excelentes marcadores de eventos exocióticos, pois estes fluoroforos sensíveis ao pH são extintos dentro do lúmen vesícula ácido e fluoresce imediatamente após a abertura do poro de fusão entre a vesícula e a membrana plasmática1. Após a abertura dos poros de fusão, a fluorescência decai exponencialmente, com alguma heterogeneidade que revela informações sobre o evento de fusão. Aqui, um aplicativo de interface de usuário gráfico (GUI) é descrito que detecta e analisa automaticamente eventos exocióticos. Este aplicativo permite que o usuário detecte automaticamente eventos exocióticos revelados pelos marcadores sensíveis ao pH2 e gere recursos de cada evento que podem ser usados para fins de classificação3 (Figura 1A). Além disso, a análise do agrupamento de eventos exocióticos usando a função K de Ripley é descrita.
A classificação automatizada de eventos exocióticos em diferentes modos exocióticos foi relatada recentemente3. Dois modos de exocistose, fusão de vesícula completa (FVF) e excitose de fusão de beijo e fuga (KNR) foram descritos anteriormente4,5,6,7. Durante a FVF, o poro de fusão dilata, e a vesícula é incorporada na membrana plasmática. Durante o KNR, o poro de fusão abre transitoriamente e depois seeals4,5,8,9,10. Foram identificados quatro modos de exocitose no desenvolvimento de neurônios, dois relacionados à FVF e dois relacionados à KNR. Este trabalho demonstra que tanto fvf quanto KNR podem ser subdivididos em eventos de fusão que procedem imediatamente à decadência de fluorescência (FVFi e KNRi) após abertura de poros de fusão ou eventos exocióticos que exibem um atraso após a abertura do poros de fusão antes da decadência da fluorescência (FVFd e KNRd)(Figura 1B). O classificador identifica o modo de exocitose para cada evento de fusão. Aqui esta análise foi incorporada em uma GUI que pode ser instalada em sistemas operacionais baseados em MATLAB em Windows e Mac. Todos os arquivos de análise podem ser encontrados em https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing ou
https://github.com/GuptonLab.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ao usar o software de detecção e análise exocítico, considere que o programa só aceita compactação sem perdas .tif arquivos como entrada. Os arquivos de imagem .tif podem ser imagens de 8 bits, 16 bits ou 32 bits em escala de cinza (canal único). Outros formatos de imagem devem ser convertidos em um desses tipos antes da entrada. Para referência, exemplos usados aqui são imagens em escala de cinza de 16 bits.
Inerentes ao processo de detecção automatizada, os conjuntos de imagens t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dustin Revell e Reginald Edwards por testarem o código e a GUI. O financiamento foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde apoiados nesta pesquisa: incluindo R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) e F31NS103586 (FLU).
Materials
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
Referências
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