Detección y análisis automatizados de exocitosis
Summary
Desarrollamos un software automatizado de visión por computadora para detectar eventos exocióticos marcados por sondas fluorescentes sensibles al pH. Aquí, demostramos el uso de una interfaz gráfica de usuario y RStudio para detectar eventos de fusión, analizar y mostrar parámetros espaciotemporales de fusión y clasificar eventos en distintos modos de fusión.
Abstract
La microscopía TIRF de lapso de tiempo de GFP sensible al pH (pHluorin) unida a las proteínas SNARE de vesícula es un método eficaz para visualizar eventos exocíticos de vesícula única en cultivo celular. Para realizar una identificación y análisis imparcial y eficiente de dichos eventos, se desarrolló e implementó en MATLAB un enfoque basado en la visión por computadora. La canalización de análisis consiste en un algoritmo de segmentación celular e identificación de eventos exocíticos. El enfoque de visión por computadora incluye herramientas para investigar múltiples parámetros de eventos individuales, incluida la vida media de la desintegración por fluorescencia y el pico de ΔF / F, así como el análisis de células enteras de la frecuencia de la exocitosis. Estos y otros parámetros de fusión se utilizan en un enfoque de clasificación para distinguir distintos modos de fusión. Aquí, una GUI recién construida realiza la canalización de análisis de principio a fin. La adaptación adicional de la función K de Ripley en R Studio se utiliza para distinguir entre la ocurrencia agrupada, dispersa o aleatoria de eventos de fusión tanto en el espacio como en el tiempo.
Introduction
Las construcciones VAMP-pHluorin o el receptor de transferrina (TfR)-pHuji son excelentes marcadores de eventos exocióticos, ya que estos fluoróforos sensibles al pH se apagan dentro de la luz de la vesícula ácida y la fluorescencia inmediatamente después de la apertura del poro de fusión entre la vesícula y la membrana plasmática1. Después de la apertura del poro de fusión, la fluorescencia decae exponencialmente, con cierta heterogeneidad que revela información sobre el evento de fusión. Aquí, se describe una aplicación de interfaz gráfica de usuario (GUI) que detecta y analiza automáticamente los eventos exocióticos. Esta aplicación permite al usuario detectar automáticamente eventos exocióticos revelados por marcadores sensibles al pH2 y generar características a partir de cada evento que pueden ser utilizadas para fines de clasificación3 (Figura 1A). Además, se describe el análisis de la agrupación de eventos exocióticos utilizando la función K de Ripley.
Recientemente se informó de la clasificación automatizada de eventos exocióticos en diferentes modos exocióticos3. Se han descrito previamente dos modos de exocitosis, la fusión de vesícula completa (FVF) y la exocitosis de fusión de beso y corrido (KNR)4,5,6,7. Durante la FVF, el poro de fusión se dilata y la vesícula se incorpora a la membrana plasmática. Durante KNR, el poro de fusión se abre transitoriamente y luego vuelve a sesar4,5,8,9,10. Se identificaron cuatro modos de exocitosis en neuronas en desarrollo, dos relacionados con FVF y dos relacionados con KNR. Este trabajo demuestra que tanto FVF como KNR se pueden subdividir en eventos de fusión que proceden inmediatamente a la desintegración de la fluorescencia (FVFi y KNRi) después de la apertura del poro de fusión o eventos exocíticos que exhiben un retraso después de la apertura del poro de fusión antes de que comience la desintegración por fluorescencia (FVFd y KNRd)(Figura 1B). El clasificador identifica el modo de exocitosis para cada evento de fusión. Aquí este análisis se ha incorporado en una GUI que se puede instalar en MATLAB en sistemas operativos basados en Windows y Mac. Todos los archivos de análisis se pueden encontrar en https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing o
https://github.com/GuptonLab.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al utilizar el software de detección y análisis exocítico, tenga en cuenta que el programa solo acepta la compresión sin pérdidas .tif archivos como entrada. Los archivos de imagen .tif pueden ser imágenes de escala de grises (un solo canal) de 8 bits, 16 bits o 32 bits. Otros formatos de imagen deben convertirse a uno de estos tipos antes de la entrada. Como referencia, los ejemplos utilizados aquí son imágenes en escala de grises de 16 bits.
Inherentes al proceso de detección automa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dustin Revell y Reginald Edwards por probar el código y la GUI. Los Institutos Nacionales de Salud proporcionaron fondos para apoyar esta investigación: incluidos R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) y F31NS103586 (FLU).
Materials
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
Referências
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