Vi udviklede automatiseret computer vision software til at opdage exocytiske hændelser præget af pH-følsomme fluorescerende sonder. Her demonstrerer vi brugen af en grafisk brugergrænseflade og RStudio til at registrere fusionshændelser, analysere og vise spatiotemporale parametre for fusion og klassificere hændelser i forskellige fusionstilstande.
Timelapse TIRF mikroskopi af pH-følsomme GFP (pHluorin) knyttet til vesikel SNARE proteiner er en effektiv metode til at visualisere enkelt vesikel exocytiske begivenheder i cellekulturen. For at udføre en upartisk, effektiv identifikation og analyse af sådanne hændelser blev der udviklet og implementeret en computervisionsbaseret tilgang i MATLAB. Analysepipelinen består af en cellesegmentering og en algoritme til identifikation af exocytiske begivenheder. Computersynsmetoden omfatter værktøjer til undersøgelse af flere parametre for enkelthændelser, herunder halveringstid for fluorescens henfald og peak ΔF/F samt helcelleanalyse af hyppigheden af exocytose. Disse og andre fusionsparametre anvendes i en klassificeringsmetode til at skelne mellem forskellige fusionstilstande. Her udfører en nybygget GUI analysepipeline fra start til slut. Yderligere tilpasning af Ripleys K-funktion i R Studio bruges til at skelne mellem grupperet, spredt eller tilfældig forekomst af fusionshændelser i både rum og tid.
VAMP-pHluorin konstruerer eller transferrin receptor (TfR)-pHuji konstruktioner er fremragende markører for exocytiske begivenheder, da disse pH-følsomme fluorophorer slukkes i syre vesikel lumen og fluoresce umiddelbart efter fusion pore åbning mellem vesikel og plasmamembran1. Efter fusion pore åbning, henfalder fluorescens eksponentielt, med en vis heterogenitet, der afslører oplysninger om fusion begivenhed. Her beskrives et grafisk brugergrænsefladeprogram, der automatisk registrerer og analyserer exocytiske hændelser. Denne applikation giver brugeren mulighed for automatisk at registrere exocytiske hændelser afsløret af pH-følsomme markører2 og generere funktioner fra hver hændelse, der kan bruges til klassificeringsformål3 (Figur 1A). Derudover beskrives analyse af exocytisk hændelsesklynge ved hjælp af Ripleys K-funktion.
Den automatiserede klassificering af exocytiske hændelser i forskellige exocytiske tilstande blev for nylig rapporteret3. To former for exocytose, fuld-vesikel fusion (FVF) og kys-og-run fusion (KNR) exocytose er tidligere blevet beskrevet4,5,6,7. Under FVF udvides fusionsporen, og vesikel er indarbejdet i plasmamembranen. Under KNR åbner fusionsporen forbigående og reseals4,5,8,9,10. Fire former for exocytose blev identificeret i udviklingen af neuroner, to relateret til FVF og to relateret til KNR. Dette arbejde viser, at både FVF og KNR yderligere kan opdeles i fusion begivenheder, der går straks til fluorescens henfald (FVFi og KNRi) efter fusion pore åbning eller exocytiske begivenheder, der udviser en forsinkelse efter fusion pore åbning før fluorescens henfald begynder (FVFd og KNRd) (Figur 1B). Klassificeringen identificerer exocytosemåden for hver fusionshændelse. Her er denne analyse blevet indarbejdet i en GUI, der kan installeres i MATLAB i Windows- og Mac-baserede operativsystemer. Alle analysefiler kan findes på https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing eller
https://github.com/GuptonLab.
Når du bruger den exocytiske detektions- og analysesoftware, skal du overveje, at programmet kun accepterer tabsfri komprimering .tif filer som input. De .tif billedfiler kan være 8-bit, 16-bit eller 32-bit gråtonebilleder (enkeltkanalsbilleder). Andre billedformater skal konverteres til en af disse typer, før der indtastes. Som reference er eksempler, der bruges her, 16-bit gråtonebilleder.
Tidslapsbilledsættene, der er indbygget i den automatiserede detektionsproces, behandles til auto…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dustin Revell og Reginald Edwards for testkode og GUI. Finansieringen blev ydet af National Institutes of Health støttede denne forskning: herunder R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG), og F31NS103586 (FLU).
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |