Un modelo quirúrgico modificado de isquemia de la extremidad posterior en ApoE-/- Ratones que usan una incisión en miniatura

Summary

Este artículo demuestra un enfoque quirúrgico eficiente para establecer la isquemia aguda en ratones con una pequeña incisión. Este enfoque puede ser aplicado por la mayoría de los grupos de investigación sin ninguna actualización de laboratorio.

Abstract

El propósito de este estudio es introducir y evaluar un enfoque quirúrgico modificado para inducir isquemia aguda en ratones que se puede implementar en la mayoría de los laboratorios de animales. Contrariamente al enfoque convencional para la doble ligadura de la arteria femoral (DLFA), se realizó una incisión más pequeña en la región inguinal derecha para exponer la arteria femoral proximal (FA) para realizar DLFA. Luego, usando una sutura de 7-0, la incisión se arrastró a la región de la rodilla para exponer la FA distal. Se utilizó una resonancia magnética (MRI) en las extremidades posteriores bilaterales para detectar la oclusión de FA después de la cirugía. A los 0, 1, 3, 5 y 7 días después de la cirugía, la recuperación funcional de las extremidades posteriores se evaluó visualmente y se calificó utilizando la escala de Tarlov. La evaluación histológica se realizó después de la eutanasia de los animales 7 días después de DLFA. Los procedimientos se realizaron con éxito en la pierna derecha en diez ratones ApoE^-/-, y ningún ratón murió durante la observación posterior. Los tamaños de la incisión en los 10 ratones fueron inferiores a 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). Los resultados de la resonancia magnética mostraron que el flujo sanguíneo de FA en el lado isquémico estaba claramente bloqueado. Los resultados de la escala de Tarlov demostraron que la función de la extremidad posterior disminuyó significativamente después del procedimiento y se recuperó lentamente durante los siguientes 7 días. La evaluación histológica mostró una respuesta inflamatoria significativa en el lado isquémico y una densidad microvascular reducida en la extremidad posterior isquémica. En conclusión, este estudio introduce una técnica modificada utilizando una incisión en miniatura para realizar isquemia de las extremidades posteriores (HLI) utilizando DLFA.

Introduction

Existe una necesidad insatisfecha de modelos animales preclínicos para la investigación en enfermedades vasculares como la enfermedad arterial periférica (EAP). A pesar de los avances avanzados en el diagnóstico y el tratamiento, hubo más de 200 millones de pacientes con EAP en 2018¹, y su número aumenta constantemente. Aunque se han descrito varios enfoques terapéuticos novedosos^2,3,4,5,6,7, la traducción exitosa de estas modalidades terapéuticas en la aplicación clínica sigue siendo una tarea desalentadora. Por lo tanto, se requieren modelos experimentales in vivo confiables y relevantes que simulen la condición de la enfermedad humana para investigar el mecanismo potencial y la eficiencia de estos nuevos enfoques terapéuticos para tratar la EAP^6,7.

La hiperlipidemia y la aterosclerosis (EA) son los principales factores de riesgo para el desarrollo de la EAP. Los ratones ApoE^-/- (con una dieta alta en grasas) muestran un metabolismo anormal de las grasas e hiperlipidemia y posteriormente desarrollan placas ateroscleróticas que convierten a los ratones en ApoE^-/- como la mejor opción para simular la EAP clínicamente relevante. Los modelos animales preclínicos de HLI se generan a través de la doble ligadura de la arteria femoral (DLFA), que es el enfoque más utilizado en laboratorios de todo el mundo^{8,9,10,11, 12,13, 14,15} para simular isquemia aguda sobre crónica. Sin embargo, este enfoque generalmente requiere una incisión relativamente grande e invasiva. Además, conduce inevitablemente a que los animales (especialmente los ratones) sufran un aumento de la lesión por dolor y la inflamación, lo que también influye en los resultados experimentales posteriores^5,6,16,17. Este artículo describe un modelo de HLI agudo sobre crónico en ratones APOE^-/- mediante el uso de una incisión muy pequeña.

Protocol

NOTA: Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la directriz CE 2010/63/EU y han sido aprobados por la legislación local alemana (35-9185.81/G[1]239/18). Diez ratones machos ApoE-/- con el fondo C57BL /6J, con un peso de 29.6-38.0 g, fueron alojados en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h y alimentados con una dieta occidental (1.25% de colesterol y 21% de grasa) y agua ad libitum durante 12 semanas a partir de la edad de 8 semanas. HLI se realizó en ratones de 20 semanas d…

Representative Results

Características de los ratones ApoE-/- Las cirugías DLFA se realizaron con éxito en 10 ratones para establecer el modelo HLI, y ninguno de los ratones murió después del procedimiento. Para seguir los cambios en el peso corporal, los ratones fueron pesados antes del procedimiento DLFA (Pre-DLFA) y 7 días después de la cirugía DLFA (Post-DLFA). Los pesos pre-DLFA variaron de 29,6 a 38,0 g (media 34,74 ± 2,47 g), y los pesos post-DLFA variaron de 26…

Discussion

Este estudio informa un enfoque modificado, simplificado y quirúrgicamente eficiente para establecer un modelo de HLI en ratones ApoE^-/- utilizando doble ligadura en las regiones proximal y distal de la FA a través de una incisión de 3-4 mm sin ninguna actualización de laboratorio requerida. La principal característica de este método es el menor tamaño de la incisión en comparación con los estudios previamente informados que describen modelos de HLI de^{ratón 8,<…}

Materials

10x Phosphate buffer saline	Roth	9143.1	Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
30% H2O2	Roth	9681.2	Used for immunohistochemistry stain
6-0 absorbable sutures	PROLENE	8776H	Used for stitching the skin
6-0 absroable suture	PROLENE	EP8706	Used in Surgery
7-0 absorbable sutures	PROLENE	EH8021E	Used for ligating the artery
7-0 absroable suture	PROLENE	EP8755	Used in Surgery
Acetic acid	Roth	6755.1	Used for haematoxylin and eosin stain
Albumin Fraktion V	Roth	8076.2	Used for immunohistochemistry stain
Autoclave	Systec GmbH	Systec VX-150	Used for the sterilisation of the surgical instruments
Axio vert A1 microscope	Carl Zeiss	ZEISS Axio Vert.A1	Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Bruker BioSpec 94/20 AVIII	Bruker Biospin MRI GmbH	N/A	Scan the femoral artery blockage
Buprenovet Sine 0,3mg/ml	Bayer AG	2542 (WDT)	Used in post operative pain-management. Dose – 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation
CD31 antibody	Abcam	ab28364	Used for immunohistochemistry stain
Eosin Y solution 0.5 % in water	Roth	X883.1	Used for haematoxylin and eosin stain
Epitope Retrieval Solution pH 6	Leica Biosystems	6046945	Used for immunohistochemistry stain
Ethanol ≥ 99,5 %	Roth	5054.1	Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Fentanyl	Cayman Chemical	437-38-7	Used for anesthesia
Fine point forceps	Medixplus	93-4505S	Used for separating the artery from nerve and vein
Glass bead sterilisator	Simon Keller	Type 250	Used for sterilisation of the surgical instruments
Graefe iris forceps curved	VUBU	VUBU-02-72207	Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue
Hair Remover cream, Veet (with aloe vera)	Reckitt Benckiser	108972	Remove hair from mice hind limbs
Heating plate	STÖRK-TRONIC	7042092	Keep the satble temperature of mice
Hematoxylin	Roth	T865.2	Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Leica surgical microscope	Leica	M651	Enlarge the field of view to facilitate the operation
Liquid DAB+Substrate Chromogen System	Dako	K3468	Used for immunohistochemistry stain
Male ApoE-/- mice	Charles River Laboratories	N/A	Used for establish the Peripheral artery disease mice model
Medetomidine	Cayman Chemical	128366-50-7	Used for anesthesia
Micro Needle Holder	Black & Black Surgical	B3B-18-8	Holding the needle
Micro suture tying forceps	Life Saver Surgical Industries	PS-MSF-145	Used to assist in knotting during surgery
Microtome	Biobase	Bk-Mt268m	Used for tissue sectioning
Midazolam	Ratiopharm	44856.01.00	Used for anesthesia
MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025	SA Instruments	N/a	monitoring vital signs of animal during MRI scan
Octeniderm farblos	Schülke & Mayr GmbH	180212	used for disinfection of the skin
Ointment for the eyes and nose	Bayer AG	1578675	Keep the eyes wet under the anesthesia
Paraformaldehyde	Roth	0335.1	Used for fixation of the tissue
Pentobarbital	Nembutal	76-74-4	Used for anesthesia
Saline	DeltaSelect	1299.99.99	Used for anesthesia
Spring handle scissors with fine, sharp tips	Black & Black Surgical	B66167	Used for cutting the artery
SuperCut Scissors	Black & Black Surgical	B55992	Used for cutting the skin
Triton X-100	Roth	9002-93-1	Used for immunohistochemistry stain
Western diet, 1.25% Cholesterol	ssniff Spezialdiäten GmbH	E15723-34	Diet for the mice
Xylene	Roth	4436.3	Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain