ثقافات الكلى البشرية tubuloid تمثل نموذجا قيما في المختبر لدراسة فسيولوجيا الكلى والمرض. يمكن إنشاء الأنابيب من أنسجة الكلى (صحية ومرضية) وكذلك البول ، وهذا الأخير يمثل مصدرا يسهل الحصول عليه وأقل غزوا للمواد البحثية.
يمكن إنشاء الخلايا الجذعية للبالغين (ASC) المشتقة من الأعضاء الظهارية للكلى البشرية ، أو الدرنات ، من ظهارة الكلى السليمة والمرضى بكفاءة عالية. الأنابيب الكلى العادية تلخيص العديد من جوانب نسيج المنشأ. وهي تمثل شرائح الكلية متميزة – وأبرزها من أنبوب قريب، حلقة من هنل، الأنابيب البعيدة، وجمع القناة – ويمكن استخدامها لدراسة فسيولوجيا الكلى العادية. وعلاوة على ذلك، فإن تكنولوجيا التوبيلويد تسهل نمذجة الأمراض، على سبيل المثال،للأمراض المعدية وكذلك للسرطان. الحصول على خلايا ظهارية الكلى لتوليد التوبيلويد، ومع ذلك، يعتمد على بقايا المواد الجراحية (مثل جزئية) استئصال الكلية) أو خزعات إبرة. القدرة على زراعة الدرنات من البول من شأنه أن يوفر مصدرا بديلا، أقل الغازية من الخلايا الظهارية الكلى صحية. وقد ثبت سابقا أن الثقافات الدرنية يمكن أن تتولد بنجاح من بضع ملليلترات فقط من البول التي تم جمعها حديثا. توضح هذه المقالة بروتوكولات توليد ونشر ثقافات أنبوبية الكلى البشرية المشتقة من ASC من عينات الأنسجة والبول.
الكلى أداء وظيفة التحكم بشكل منهجي في توازن سوائل الجسم. يمكن أن يكون سبب ضعف وظيفتها الفسيولوجية عوامل مختلفة، بما في ذلك مرض السكري وارتفاع ضغط الدم والسمية الناجمة عن المخدرات1. لفهم أفضل لعلم وظائف الأعضاء الكلى الطبيعية، فضلا عن تطوير أمراض الكلى, استخدام نماذج ما قبل السريرية التمثيلية أمر بالغ الأهمية. في السنوات الأخيرة، تم إنشاء العديد من نماذج الكلى في المختبر على أساس ما يسمى تكنولوجيا organoid2. الأجهزة العضوية هي هياكل ثلاثية الأبعاد ومتعددة الخلايا تشبه مورفولوجيا وفسيولوجيا الأنسجة (طبيعية أو مريضة) التي تنشأ منها. ويمكن أن تنشأ من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات أو الخلايا الجذعية البالغة، ولكل منها خصائصه وتطبيقاته الخاصة.
PSC المشتقة من أعضاء الكلى تحاكي تولدالكلية 3،4،5. ويمكن أيضا أن تنشأ من الخلايا الملتزمة المشتقة من المريض عن طريق dedifferentiation القسري (المستحث pluripotency أو iPSC). ويمكن في وقت لاحق iPSCs أن تكون متباينة في أنواع مختلفة من الخلايا من الكلية، وحدة وظيفية من الكلى، من خلال التعرض في الوقت المناسب لكوكتيلات عامل النمو محددة. في حين خلق جهاز مصغرة كاملة نوعا ما في طبق، وإنشاء لا يزال مضيعة للوقت، ونظرا لبروتوكول إعادة البرمجة، iPSCs يمكن أن تكون عرضة لعدم الاستقرار الوراثي غير مرغوب فيه6. وعلاوة على ذلك، فإن أعضاء iPSC غير قادرة على النضج الكامل في خلايا الكلى البالغة، مما يكشف عن ملف تعريف النسخ الذي يشبه كلية الجنين في مرحلة النمو المبكر7.
وقد ثبت أن أنبوبيات الكلى البشرية المشتقة من ASC تلخص تجديد ظهارة الكلى للبالغين. وهي تمثل في المقام الأول أنبوبي قريب، حلقة من هنل، الأنابيب البعيدة، وجمع القناة، كما أكد التعبير عن البروتينات الناقلمختلفة 8،9،10. يسمح بروتوكول زراعة الدرنات بالتوسع السريع في أنسجة الكلى المشتقة من المريض ، مع الاحتفاظ بجينوم مستقر. وتشمل التطبيقات البحثية دراسة فسيولوجيا الكلى الطبيعية، والسمية الكلوية، واختبار المخدرات، فضلا عن نمذجة المرض8،10،11،12. وهناك قيود محتملة على إنشاء الثقافات العضوية المشتقة من المريض، بما في ذلك الدرنات، هو توافر الأنسجة الطازجة. ومع ذلك، أظهرت العديد من التقارير أن البول يمكن أن تكون بمثابة مصدر للخلايا الظهارية الكلى، وبالتالي توفير أبسط بكثير، وأقل الغازية استراتيجية للحصول على مواد المريض لثقافات الدرنية8،13،14. في الواقع، وقد تبين مؤخرا أن الدرنات يمكن زراعتها من البول8. هذه المقالة يصف إنشاء وصيانة الثقافات الدرنية من أنسجة الكلى والبول.
تعتبر الأجهزة العضوية صورا رمزية للأنسجة التي تستمد منها. أنها تسمح للتوسع السريع للمواد المريض مع الاحتفاظ بالخصائص الجينية والفينوتينوتيبيك من نسيج المنشأ15. وقد فتحت تكنولوجيا Organoid مؤخرا الأبواب لتطوير نماذج أكثر تمثيلا قبل السريرية، والتي يمكن استخدامها كأدوات هامة لترجمة النتائج من مقاعد البدلاء إلى السرير. الدرنات الكلى واعدة في نماذج المختبر لاختبار السمية الكلوية الناجمة عن المخدرات, أحد الآثار الجانبية الشائعة للعديد من الأدوية العلاج الكيميائي2,8,12. على هذا النحو ، ثبت أن الثقافات العضوية السرطانية المشتقة من المريض تنبؤية لاستجابة المريض للعلاج16و17و18. اختبار الأدوية بطريقة عالية الإنتاجية على tubuloids وبالتالي يحتمل أن يسمح تعريف أفضل للنوافذ العلاجية ويقلل من خطر السمية الكلوية الناجمة عن المخدرات في المرضى.
وقد وصفت المضادات الحيوية المستخدمة عادة لممارسة تأثير سام على الكلى19. على الرغم من أن وجود المضادات الحيوية واسعة الطيف ضروري لنجاح إنشاء الثقافات عن طريق منع التلوث ، فمن المهم النظر في السمية الكلوية المحتملة. على الرغم من عدم ملاحظة أي آثار سلبية للمضادات الحيوية على إنشاء زراعة الدرنويد ، هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق لتقييم آثارها بدقة. يمكن استغلال التوبولويدات لدراسة ونمذجة الأمراض8. يمكن دراسة اعتلالات السيليوباثية (الخلل المرضي في الأهداب) وكذلك المتلازمات الوراثية الأخرى التي تؤثر على الكلى إما عن طريق توليد خطوط الدرنات مباشرة من الأشخاص المصابين ، أو باستخدام ثقافات صحية يمكن فيها إدخال طفرات السائق الخاصة بالأمراض عن طريق CRISPR / Cas9 تحرير الجينوم20.
على الرغم من أن الدرنات هي ثقافات الكلى متعددة الخلايا ، إلا أنها تفتقر إلى العديد من أنواع الخلايا الكلوية ، بما في ذلك الخلايا البودولاتية والخلايا البطانية8. وعلاوة على ذلك، وعلى النقيض من بعض النماذج العضوية الأخرى المشتقة من ASC، فإن الدرنات لديها إمكانات تكرارية محدودة حيث يمكن استزراعها لما يقرب من 15 مقطعا. هذا العمر المحدود يمكن ، ومع ذلك ، يمكن تمديده بشكل كبير من خلال إضافة Wnt إلى الثقافة المتوسطة21. مطلوب مزيد من التحسين من بروتوكول ثقافة الدرنات لجعلها أكثر تمثيلا للكلى، بما في ذلك أنواع الخلايا أكثر تمايزا. على الرغم من أن كفاءة إنشاء الدرنات من عينات الأنسجة عالية جدا (>95٪) ، إلا أنها يمكن أن تفشل في حالات نادرة. يمكن أن تكون هناك أسباب مختلفة بما في ذلك: 1) نوعية رديئة من المواد بدءا(على سبيل المثال،الأنسجة النخرية نتيجة للعلاج من المخدرات)، 2) الإفراط في عسر الهضم من عينة الأنسجة، أو 3) تلوث العينة الأولية.
للتأكد من أن جودة عينات الأنسجة المستلمة كافية للمضي قدما في البروتوكول ، من المهم الحفاظ على اتصال وثيق مع موظفي علم الأمراض الذين يجرون تقييم الأنسجة عند الجراحة. إذا كانت هناك مواد كافية متاحة، يجب التأكد من صلاحيتها عن طريق الفحص النسيجي(على سبيل المثال. وعلاوة على ذلك، لمنع تحلل الخلية أثناء الهضم الأنزيمي، من المهم أن إجراء الحضانة لا يزيد عن 1 ساعة. وأخيرا، لمنع التلوث، ينبغي إضافة المضادات الحيوية والعوامل المضادة للفطريات إلى وسائل الإعلام الغسيل والثقافة.
البول يمكن أن تحتوي على خلايا الظهارية تقشير التي لا تستمد من الكلى22, التي يمكن أن تلوث الثقافات الدرنية. وتشمل هذه, على سبيل المثال, خلايا المسالك البولية التي هي, على النقيض من الخلايا الأنبوبية الكلوية, إيجابية للبروتين الورم P63 والسلبية لP PAX88. ولذلك فمن المستحسن لاختبار الثقافات الإيجابية PAX8 لتأكيد نقاء خطوط أنبوبي الكلى المنشأة قبل الشروع في متابعة التجارب(الشكل 4B).
يمثل البول بيئة معادية للخلايا بسبب ارتفاع الضغط التناضحي وانخفاض درجة الحموضة. ولذلك فمن الأهمية بمكان لنجاح البروتوكول أن تتم معالجة العينات في أقرب وقت ممكن عند جمع البول. على هذا النحو ، يجب تخفيف البول الذي تم جمعه وغسله على نطاق واسع بمحلول عازل في أقرب وقت ممكن لضمان وجود خلايا قابلة للحياة في وقت البذر. معدل نجاح إنشاء أنبوبي سينخفض بشكل ملحوظ إذا تم تخزين البول لعدة ساعات قبل المعالجة. وأخيرا، على الرغم من العقيمة، البول لديه مخاطر عالية من التلوث المرتبطة بعملية جمع. ولذلك فمن المهم لتكملة الغسيل والنمو المتوسطة مع المضادات الحيوية والعوامل المضادة للفطريات. عند أخذ كل ما سبق في الاعتبار، يمكن تحقيق معدل نجاح يبلغ حوالي 50٪.
The authors have nothing to disclose.
نشكر جميع المرضى وأسرهم على مشاركتهم في الدراسة. نشكر الفريق السريري الذي سهل أبحاثنا. نحن ممتنون لدعم مجلس البحوث الأوروبي (ERC) منحة البدء 850571 (J.D.) ، وجمعية السرطان الهولندية (KWF) / جائزة Alpe d’HuZes Bas Mulder (رقم 10218 ، J.D.) ، معهد Oncode ، ومؤسسة الأطفال الخالية من السرطان (KiKa no. 292 ، C.C).
A83-01 | Tocris | 2939/10 | Stock of 5 mM, final concentration of 5 µM, activin receptor-like kinase 5 inhibitor |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634010 | |
antiPAX8 antibody | LSBio | LS-B13466 | |
B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | Stock of 50x, final concentration of 1x |
BME | Trevigen | 3533-010-02 | |
Collagenase | Sigma Aldrich | C9407 | Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL |
EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL |
GlutaMAX – L-alanine/L-glutamine | Gibco | 35050061 | Stock of 100x, final concentration of 1x |
Hepes | Gibco | 15630106 | Stock of 1 M, final concentration of 10 mM |
Multiwell tissue culture plates 12 wells | CELLSTAR | 665180 | |
Multiwell tissue culture plates 24 wells | CELLSTAR | 662160 | |
Multiwell tissue culture plates 6 wells | CELLSTAR | 657160 | |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140163 | Stock of 10.000 U/mL, final concentration of 100 U/mL |
Primocin – broad-range antibiotics | Invivogen | ant-pm-1 | Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL |
Red blood cells lysis buffer | Roche | 11814389001 | |
RhoKinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817 | Stock of 100 mM, final concentration of 10 µM |
R-spondin conditioned medium | Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10% | ||
TrypLe Express/ trypsin replacement agent | ThermoFisher Scientific | 12605010 |