Coloration immunofluorescente pour la visualisation des protéines associées à l’hétérochromatine dans les glandes salivaires de la drosophile

Summary

Ce protocole vise à visualiser les agrégats d’hétérochromatine dans les cellules de polytène de drosophile.

Abstract

La visualisation des agrégats d’hétérochromatine par immunostaining peut être provocante. De nombreux composants mammifères de la chromatine sont conservés chez Drosophila melanogaster. Par conséquent, c’est un excellent modèle pour étudier la formation et l’entretien de l’hétérochromatine. Les cellules polyténisées, telles que celles trouvées dans les glandes salivaires des larves de D. melanogaster du troisième stade, fournissent un excellent outil pour observer la chromatine amplifiée près de mille fois et ont permis aux chercheurs d’étudier les changements dans la distribution de l’hétérochromatine dans le noyau. Bien que l’observation des composants de l’hétérochromatine puisse être effectuée directement dans des préparations chromosomiques polytènes, la localisation de certaines protéines peut être modifiée par la gravité du traitement. Par conséquent, la visualisation directe de l’hétérochromatine dans les cellules complète ce type d’étude. Dans ce protocole, nous décrivons les techniques immunostaining utilisées pour ce tissu, l’utilisation des anticorps fluorescents secondaires, et la microscopie confocale d’observer ces agrégats d’hétérochromatine avec une plus grande précision et détail.

Introduction

Depuis les premières études d’Emil Heitz^1,l’hétérochromatine a été considérée comme un régulateur important des processus cellulaires tels que l’expression des gènes, la séparation méiotique et mitotique des chromosomes et le maintien de la stabilité du génome^2,3,4.

L’hétérochromatine est principalement divisée en deux types: l’hétérochromatine constitutive qui définit de manière caractéristique les séquences répétitives, et les éléments transposables qui sont présents à des sites chromosomiques spécifiques tels que les télomères et les centromères. Ce type d’hétérochromatine est principalement défini épigénétiquement par des marques d’histones spécifiques telles que la di ou tri-méthylation de la lysine 9 de l’histone H3 (H3K9me3) et la liaison de la protéine hétérochromatine 1a (HP1a)5,6. D’autre part, l’hétérochromatine facultative se localise à travers les bras du chromosome et se compose principalement de gènes^7,8. L’immunomarquage de blocs d’hétérochromatine dans les cellules métaphases, ou l’observation d’agrégats d’hétérochromatine dans les cellules interphases, a dévoilé beaucoup de lumière dans la compréhension de la formation et de la fonction des régions hétérochromatiques^9.

L’utilisation de la drosophile comme système modèle a permis le développement d’outils essentiels pour étudier l’hétérochromatine sans l’utilisation de la microscopie électronique¹⁰. Depuis la description de la panachation de l’effet de position et la découverte de protéines associées à l’hétérochromatine, telles que HP1a, et de modifications post-traductionnelles des histones, de nombreux groupes ont développé plusieurs techniques immunohistochimiques qui permettent la visualisation de ces régions hétérochromatiques^10,11.

Ces techniques sont basées sur l’utilisation d’anticorps spécifiques qui reconnaissent les protéines associées à l’hétérochromatine ou les marques d’histones. Pour chaque type de cellule et anticorps, les conditions de fixation et de perméabilisation doivent être déterminées empiriquement. En outre, les conditions peuvent varier si des procédés mécaniques supplémentaires tels que des techniques d’écrasement sont utilisés. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation des glandes salivaires de drosophile d’étudier les foyers hétérochromatiques. Les glandes salivaires ont des cellules polyténisées qui contiennent plus de 1 000 copies du génome, fournissant ainsi une vue amplifiée de la plupart des caractéristiques de la chromatine, à l’exception de l’ADN satellite et de certaines régions hétérochromatiques qui sont sous-répliquées. Néanmoins, les régions d’hétérochromatine sont facilement visualisées dans des préparations de chromosome de polytène, mais les techniques d’écrasement peuvent parfois perturber des complexes caractéristiques liés à la chromatine ou l’architecture de chromatine. Par conséquent, l’immunolocalisation des protéines dans le tissu entier des glandes salivaires peut dépasser ces effets indésirables. Nous avons utilisé ce protocole pour détecter plusieurs protéines liées à la chromatine, et nous avons démontré que ce protocole combiné avec des stocks de drosophile mutants peut être utilisé pour étudier la perturbation de l’hétérochromatine^12.

Protocol

1. Culture de larves du troisième stade Préparez 1 litre de milieux standards en ajoutant 100 g de levure, 100 g de sucre de canne entier non raffiné, 16 g de gélose, 10 mL d’acide propionique et 14 g de gélatine. Dissoudre tous les ingrédients sauf la levure dans 800 mL d’eau du robinet, puis dissoudre la levure. Autoclave immédiatement pendant 30 minutes. Ensuite, laissez le support refroidir à 60 °C et ajoutez l’acide propionique à une concentration finale de 0,01 %. Laissez la boutei…

Representative Results

Les résultats représentatifs de l’immunomarquage de HP1a dans les glandes salivaires de la drosophile sont illustrés à la figure 1. Un résultat positif est d’observer un point focal(figure 1a)(agrégat ou condensat hétérochromatique). Un résultat négatif est l’absence de signal ou un signal dispersé. Parfois, un double signal peut être observé, c’est-à-dire avec un point double (Figure 1c), mais il se p…

Discussion

La fonction cellulaire des organismes eucaryotes peut définir la structure 3D dans le noyau, qui est soutenue par des interactions entre différentes protéines avec la chromatine et diverses molécules, y compris l’ARN. Au cours des trois dernières années, les condensats biologiques qui ont eu de la pertinence, y compris l’hétérochromatine, ont joué un rôle fondamental dans la détermination de la séparation de phase favorisant l’organisation spatiale nucléaire distincte de la chromatine active et répres…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen MCT-150-C	11351904	brand not critical
16% formaldehyde	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Molecular Biology Grade	Roche	10735078001	brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors	Merck	5892953001
Coverslip	Corning	CLS285022-200EA	22×22, brand not critical
DTT	Sigma	d9779	brand not critical
EDTA	Sigma	E5134	brand not critical
EGTA			brand not critical
Glass slide	Gold seal	3011	brand not critical
H3BO3	Baker	0084-01	brand not critical
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl	Baker	3040-01	brand not critical
Methanol	Baker	9070-03	brand not critical
NaCl	Sigma	71376	brand not critical
NaOH			brand not critical
PIPES			brand not critical
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	brand not critical
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, brand not critical