Protein arginin (R) -methylering er en udbredt posttranslationel modifikation, der regulerer flere biologiske veje. Massespektrometri er den bedste teknologi til globalt at profilere R-methylproteomet, når det kobles til biokemiske tilgange til modificeret peptidberigelse. Arbejdsgangen designet til identifikation med høj tillid til global R-methylering i humane celler er beskrevet her.
Protein arginin (R) -methylering er en udbredt protein posttranslationel modifikation (PTM) involveret i reguleringen af flere cellulære veje, herunder RNA-behandling, signaltransduktion, DNA-skaderespons, miRNA-biogenese og translation.
I de senere år har massespektrometri (MS) baseret proteomics takket være biokemiske og analytiske udviklinger vist sig som den mest effektive strategi til at karakterisere det cellulære methyl-proteom med single-site opløsning. Identifikation og profilering in vivo protein R-methylering af MS er imidlertid fortsat udfordrende og fejlbehæftet, hovedsagelig på grund af den substoichiometriske karakter af denne ændring og tilstedeværelsen af forskellige aminosyresubstitutioner og kemisk methylesterificering af sure rester, der er isobariske til methylering. Således kræves berigelsesmetoder til forbedring af identifikationen af R-methylpeptider og ortogonale valideringsstrategier for at reducere falske opdagelseshastigheder (FDR) i methylproteomics-undersøgelser.
Her beskrives en protokol specielt designet til identifikation og kvantificering af R-methylpeptider med høj tillid fra cellulære prøver, som kobler metabolisk mærkning af celler med tung isotopkodet methionin (hmSILAC) og dobbelt proteasefordøjelse i opløsning af helcelleekstrakt efterfulgt af off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) kromatografifraktionering og affinitetsberigelse af R-methylpeptider ved anvendelse af anti-pan-R-methylantistoffer. Efter MS-analyse i høj opløsning behandles rådata først med MaxQuant-softwarepakken, og resultaterne analyseres derefter af hmSEEKER, en software designet til dybdegående søgning af MS-toppar svarende til let og tungt methylpeptid i MaxQuant-outputfilerne.
Arginin (R)-methylering er en posttranslationel modifikation (PTM), der dekorerer omkring 1% af pattedyrproteomet1. Protein argininmethyltransferaser (PRMT’er) er enzymerne, der katalyserer R-methyleringsreaktion ved aflejring af en eller to methylgrupper til nitrogenatomerne (N) i guanidino-gruppen i sidekæden af R på en symmetrisk eller asymmetrisk måde. Hos pattedyr kan PRMT’er grupperes i tre klasser – type I, type II og type III – afhængigt af deres evne til at deponere både monomethylering (MMA) og asymmetrisk di-methylering (ADMA), MMA og symmetrisk di-methylering (SDMA) eller kun MMA, henholdsvis 2,3. PRMT’er er hovedsageligt rettet mod R-rester placeret i glycin- og argininrige regioner, kendt som GAR-motiver, men nogle PRMT’er, såsom PRMT5 og CARM1, kan methylatprolin-glycin-methioninrige (PGM) motiver4. R-methylering er opstået som en proteinmodulator af flere biologiske processer, såsom RNA-splejsning5, DNA-reparation6, miRNA-biogenese7 og translation2, hvilket fremmer forskningen på denne PTM.
Massespektrometri (MS) er anerkendt som den mest effektive teknologi til systematisk at studere global R-methylering ved protein-, peptid- og stedopløsning. Denne PTM kræver dog nogle særlige forholdsregler for at kunne identificere den med høj tillid fra medlemsstaterne. For det første er R-methylering substoichiometrisk, idet den umodificerede form af peptiderne er meget mere rigelig end de modificerede, således at massespektrometre, der opererer i DDA-tilstand (Data Dependent Acquisition), vil fragmentere højintensive umodificerede peptider oftere end deres methylerede modstykker med lavere intensitet8. Desuden lider de fleste MS-baserede arbejdsgange til identifikation af R-methylerede steder af begrænsninger på bioinformatisk analyseniveau. Faktisk er beregningsidentifikationen af methylpeptider tilbøjelig til høje falske opdagelseshastigheder (FDR), fordi denne PTM er isobarisk for forskellige aminosyresubstitutioner (f.eks. Glycin til alanin) og kemisk modifikation, såsom methylesterificering af aspartat og glutamat9. Derfor er metoder baseret på isotopmærkning af methylgrupper, såsom tung methylstabil isotopmærkning med aminosyrer i cellekultur (hmSILAC), blevet implementeret som ortogonale strategier til sikker MS-identifikation af in vivo-methyleringer , hvilket signifikant reducerer antallet af falske positive annoteringer10.
For nylig er forskellige proteom-dækkende protokoller til undersøgelse af R-methylerede proteiner blevet optimeret. Udviklingen af antistofbaserede strategier for immun-affinitetsberigelse af R-methylpeptider har ført til annotering af flere hundrede R-methylerede steder i humane celler11,12. Desuden rapporterede mange undersøgelser 3,13, at kobling af antistofbaseret berigelse med peptidseparationsteknikker såsom HpH-RP-kromatografifraktionering kan øge det samlede antal identificerede methylpeptider.
Denne artikel beskriver en eksperimentel strategi designet til systematisk og høj tillid identifikation af R-methylerede steder i humane celler baseret på forskellige biokemiske og analytiske trin: proteinekstraktion fra hmSILAC-mærkede celler, parallel dobbelt enzymatisk fordøjelse med Trypsin og LysargiNase proteaser, efterfulgt af HpH-RP kromatografisk fraktionering af fordøjede peptider kombineret med antistofbaseret immuno-affinitetsberigelse af MMA-, SDMA-, og ADMA-holdige peptider. Alle affinitetsberigede peptider analyseres derefter ved højopløsnings væskekromatografi (LC)-MS/MS i DDA-tilstand, og rå MS-data behandles af MaxQuant-algoritmen til identifikation af R-methyl-peptider. Endelig behandles MaxQuant-outputresultaterne med hmSEEKER, et internt udviklet bioinformatikværktøj til at søge par tunge og lette methylpeptider. Kort fortalt læser og filtrerer hmSEEKER methylpeptididentifikationer fra msms-filen, matcher derefter hvert methylpeptid med dets tilsvarende MS1-top i allPeptides-filen og søger endelig toppen af den tunge / lette peptid-modstykke. For hvert formodet tungt lyspar beregnes parametrene Log2 H/L-forhold (LogRatio), retentionstidsforskel (dRT) og Mass Error (ME), og dubletter, der er placeret inden for brugerdefinerede afskæringer, mærkes som sande positive. Arbejdsgangen for den biokemiske protokol er beskrevet i figur 1.
Den høje konfidensidentifikation af in vivo-protein /peptidmethylering ved global MS-baseret proteomics er udfordrende på grund af risikoen for høj FDR med flere aminosyresubstitutioner og methylesterificering, der forekommer under prøveforberedelse, der er isobariske til methylering og kan forårsage forkerte opgaver i fravær af ortogonale MS-valideringsstrategier. Den substoichiometriske karakter af denne PTM komplicerer yderligere opgaven med global methyl-proteomics, men kan overvindes med selektiv beri…
The authors have nothing to disclose.
MM og EM er ph.d.-studerende inden for European School of Molecular Medicine (SEMM). EM er modtager af et 3-årigt FIRC-AIRC-stipendium (projektkode: 22506). Globale analyser af R-methylproteomer i TB-gruppen understøttes af AIRC IG Grant (projektkode: 21834).
Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |