वैश्विक और उच्च आत्मविश्वास प्रोटीन आर-मिथाइलेशन विश्लेषण के लिए एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण
Summary
प्रोटीन आर्गिनिन (आर) -मिथाइलेशन एक व्यापक प्रसार पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है जो कई जैविक मार्गों को विनियमित करता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री संशोधित पेप्टाइड संवर्धन के लिए जैव रासायनिक दृष्टिकोण के साथ युग्मित होने पर आर-मिथाइल-प्रोटिओम को विश्व स्तर पर प्रोफाइल करने के लिए सबसे अच्छी तकनीक है। मानव कोशिकाओं में वैश्विक आर-मिथाइलेशन की उच्च आत्मविश्वास पहचान के लिए डिज़ाइन किया गया वर्कफ़्लो यहां वर्णित है।
Abstract
प्रोटीन आर्गिनिन (आर) -मिथाइलेशन एक व्यापक प्रोटीन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) है जो आरएनए प्रसंस्करण, सिग्नल ट्रांसडक्शन, डीएनए क्षति प्रतिक्रिया, एमआईआरएनए बायोजेनेसिस और अनुवाद सहित कई सेलुलर मार्गों के विनियमन में शामिल है।
हाल के वर्षों में, जैव रासायनिक और विश्लेषणात्मक विकास के लिए धन्यवाद, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित प्रोटिओमिक्स एकल-साइट संकल्प के साथ सेलुलर मिथाइल-प्रोटिओम को चिह्नित करने के लिए सबसे प्रभावी रणनीति के रूप में उभरा है। हालांकि, एमएस द्वारा विवो प्रोटीन आर-मिथाइलेशन में पहचान और प्रोफाइलिंग चुनौतीपूर्ण और त्रुटि-प्रवण बनी हुई है, मुख्य रूप से इस संशोधन की सबस्टोइकोमेट्रिक प्रकृति और विभिन्न अमीनो एसिड प्रतिस्थापन और अम्लीय अवशेषों के रासायनिक मिथाइल-एस्टरीफिकेशन की उपस्थिति के कारण जो मिथाइलेशन के लिए आइसोबेरिक हैं। इस प्रकार, मिथाइल-प्रोटिओमिक्स अध्ययनों में झूठी खोज दर (एफडीआर) को कम करने के लिए आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स और ऑर्थोगोनल सत्यापन रणनीतियों की पहचान को बढ़ाने के लिए संवर्धन विधियों की आवश्यकता है।
यहां, विशेष रूप से सेलुलर नमूनों से उच्च आत्मविश्वास वाले आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स की पहचान और मात्रा के लिए डिज़ाइन किए गए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जो भारी आइसोटोप-एन्कोडेड मेथिओनिन (एचएमएसआईएलएएसी) और पूरे सेल अर्क के दोहरे प्रोटीज इन-सॉल्यूशन पाचन के साथ कोशिकाओं के चयापचय लेबलिंग को जोड़ता है, इसके बाद ऑफ-लाइन हाई-पीएच रिवर्स्ड फेज (एचपीएच-आरपी) क्रोमैटोग्राफी फ्रैक्शनेशन और एंटी-पैन-आर-मिथाइल एंटीबॉडी का उपयोग करके आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स का आत्मीयता संवर्धन होता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन एमएस विश्लेषण पर, कच्चे डेटा को पहले मैक्सक्वांट सॉफ्टवेयर पैकेज के साथ संसाधित किया जाता है और परिणामों का विश्लेषण एचएमएसईईकेईआर द्वारा किया जाता है, जो मैक्सक्वांट आउटपुट फाइलों के भीतर हल्के और भारी मिथाइल-पेप्टाइड के अनुरूप एमएस पीक जोड़े की गहन खोज के लिए डिज़ाइन किया गया एक सॉफ्टवेयर है।
Introduction
आर्जिनिन (आर) -मिथाइलेशन एक पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) है जो स्तनधारी प्रोटिओम 1 के लगभग1% को सजाता है। प्रोटीन आर्जिनिन मेथिलट्रांसफेरेज़ (पीआरएमटी) एक सममित या असममित तरीके से आर की साइड चेन के गुआनिडिनो समूह के नाइट्रोजन (एन) परमाणुओं के लिए एक या दो मिथाइल समूहों के जमाव द्वारा आर-मिथाइलेशन प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करने वाले एंजाइम हैं। स्तनधारियों में, पीआरएमटी को तीन वर्गों में वर्गीकृत किया जा सकता है- टाइप I, टाइप II, और टाइप III- मोनो-मिथाइलेशन (एमएमए) और असममित डाइ-मिथाइलेशन (एडीएमए), एमएमए और सममित डाय-मिथाइलेशन (एसडीएमए) या केवल एमएमए, क्रमशः 2,3 दोनों को जमा करने की उनकी क्षमता के आधार पर। पीआरएमटी मुख्य रूप से ग्लाइसिन- और आर्जिनिन-समृद्ध क्षेत्रों के भीतर स्थित आर अवशेषों को लक्षित करते हैं, जिन्हें जीएआर रूपांकनों के रूप में जाना जाता है, लेकिन कुछ पीआरएमटी, जैसे कि पीआरएमटी 5 और सीएआरएम 1, प्रोलाइन-ग्लाइसिन-मेथिओनिन-समृद्ध (पीजीएम) रूपांकनोंको मिथाइलेट कर सकते हैं। आर-मिथाइलेशन कई जैविक प्रक्रियाओं के प्रोटीन मॉड्यूलेटर के रूप में उभरा है, जैसे कि आरएनए स्प्लिसिंग5, डीएनए मरम्मत6, मिआरएनए बायोजेनेसिस7, और अनुवाद2, इस पीटीएम पर शोध को बढ़ावा देते हुए।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) को प्रोटीन-, पेप्टाइड-और साइट-रिज़ॉल्यूशन पर वैश्विक आर-मिथाइलेशन का व्यवस्थित रूप से अध्ययन करने के लिए सबसे प्रभावी तकनीक के रूप में मान्यता प्राप्त है। हालांकि, इस पीटीएम को एमएस द्वारा इसकी उच्च आत्मविश्वास पहचान के लिए कुछ विशेष सावधानियों की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, आर-मिथाइलेशन सबस्टोइकोमेट्रिक है, जिसमें पेप्टाइड्स का असंशोधित रूप संशोधित लोगों की तुलना में बहुत अधिक प्रचुर मात्रा में है, इसलिए डेटा डिपेंडेंट एक्विजिशन (डीडीए) मोड में संचालित मास स्पेक्ट्रोमीटर अपने कम तीव्रता वाले मिथाइलेटेड समकक्षोंकी तुलना में अधिक बार उच्च तीव्रता वाले असंशोधित पेप्टाइड्स को विभाजित करेंगे। इसके अलावा, आर-मिथाइलेटेड साइट पहचान के लिए अधिकांश एमएस-आधारित वर्कफ़्लोज जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण स्तर पर सीमाओं से ग्रस्त हैं। दरअसल, मिथाइल-पेप्टाइड्स की कम्प्यूटेशनल पहचान उच्च झूठी खोज दर (एफडीआर) से ग्रस्त है, क्योंकि यह पीटीएम विभिन्न अमीनो एसिड प्रतिस्थापन (जैसे, एलानिन में ग्लाइसिन) और रासायनिक संशोधन, जैसे कि एस्पार्टेट और ग्लूटामेट9 के मिथाइल-एस्टरीफिकेशन के लिए आइसोबेरिक है। इसलिए, मिथाइल समूहों के आइसोटोप लेबलिंग पर आधारित विधियां, जैसे सेल कल्चर में अमीनो एसिड के साथ भारी मिथाइल स्थिर आइसोटोप लेबलिंग (एचएमएसआईएलएएसी), को विवो मिथाइलेशन में आत्मविश्वास एमएस-पहचान के लिए ऑर्थोगोनल रणनीतियों के रूप में लागू किया गया है, जिससे झूठे सकारात्मक एनोटेशन10 की दर में काफी कमी आई है।
हाल ही में, आर-मिथाइलेटेड प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रोटिओम-वाइड प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है। आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स के इम्यूनो-आत्मीयता संवर्धन के लिए एंटीबॉडी-आधारित रणनीतियों के विकास ने मानव कोशिकाओं11,12 में कई सैकड़ों आर-मिथाइलेटेड साइटों के एनोटेशन को जन्म दिया है। इसके अलावा, कईअध्ययनों 3,13 ने बताया कि एचपीएच-आरपी क्रोमैटोग्राफी फ्रैक्शनेशन जैसी पेप्टाइड पृथक्करण तकनीकों के साथ युग्मन एंटीबॉडी-आधारित संवर्धन पहचाने गए मिथाइल-पेप्टाइड्स की समग्र संख्या को बढ़ावा दे सकता है।
यह लेख विभिन्न जैव रासायनिक और विश्लेषणात्मक चरणों के आधार पर मानव कोशिकाओं में आर-मिथाइलेटेड साइटों की व्यवस्थित और उच्च-आत्मविश्वास पहचान के लिए डिज़ाइन की गई एक प्रयोगात्मक रणनीति का वर्णन करता है: एचएमएसआईएलएएसी-लेबल कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण, ट्रिप्सिन और लिसार्गिनेस प्रोटीज के साथ समानांतर डबल एंजाइमेटिक पाचन, इसके बाद पचे हुए पेप्टाइड्स के एचपीएच-आरपी क्रोमैटोग्राफिक फ्रैक्शनेशन, एमएमए-, एसडीएमए-के एंटीबॉडी-आधारित इम्यूनो-आत्मीयता संवर्धन के साथ युग्मित। और एडीएमए युक्त पेप्टाइड्स। सभी आत्मीयता-समृद्ध पेप्टाइड्स का विश्लेषण डीडीए मोड में उच्च-रिज़ॉल्यूशन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (एलसी)-एमएस / एमएस द्वारा किया जाता है, और कच्चे एमएस डेटा को आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स की पहचान के लिए मैक्सक्वांट एल्गोरिदम द्वारा संसाधित किया जाता है। अंत में, मैक्सक्वांट आउटपुट परिणामों को भारी और हल्के मिथाइल-पेप्टाइड्स के जोड़े की खोज के लिए एक इन-हाउस विकसित जैव सूचना विज्ञान उपकरण एचएमएसईकेईआर के साथ संसाधित किया जाता है। संक्षेप में, hmSEEKER MSMS फ़ाइल से मिथाइल-पेप्टाइड्स पहचान को पढ़ता है और फ़िल्टर करता है, फिर प्रत्येक मिथाइल-पेप्टाइड को ऑलपेप्टाइड्स फ़ाइल में इसके संबंधित MS1 शिखर से मेल खाता है, और अंत में, भारी / हल्के पेप्टाइड समकक्ष के शिखर की खोज करता है। प्रत्येक कथित भारी-प्रकाश जोड़ी के लिए, लॉग 2 एच / एल अनुपात (लॉगरेशियो), अवधारण समय अंतर (डीआरटी), और मास एरर (एमई) मापदंडों की गणना की जाती है, और उपयोगकर्ता-परिभाषित कट-ऑफ के भीतर स्थित डबल्स को सच्चे सकारात्मक के रूप में लेबल किया जाता है। जैव रासायनिक प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो चित्रा 1 में वर्णित है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वैश्विक एमएस-आधारित प्रोटिओमिक्स द्वारा विवो प्रोटीन / पेप्टाइड मिथाइलेशन में उच्च आत्मविश्वास की पहचान चुनौतीपूर्ण है, उच्च एफडीआर के जोखिम के कारण, नमूना तैयारी के दौरान होने वाले कई एमिनो एसिड…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एमएम और ईएम यूरोपीय स्कूल ऑफ मॉलिक्यूलर मेडिसिन (एसईएमएम) के भीतर पीएचडी छात्र हैं। ईएम 3 साल के FIRC-AIRC बर्सरी (प्रोजेक्ट कोड: 22506) का प्राप्तकर्ता है। टीबी समूह में आर-मिथाइल-प्रोटिओम के वैश्विक विश्लेषण एआईआरसी आईजी ग्रांट (प्रोजेक्ट कोड: 21834) द्वारा समर्थित हैं।
Materials
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
Referências
- Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
- Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: the coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
- Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
- Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
- Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
- Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
- Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
- Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
- Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
- Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
- Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
- Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
- Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
- Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
- Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
- Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
- Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).
