Protein arginin (R)-metylering är en vidsträckt post-translationell modifiering som reglerar flera biologiska vägar. Masspektrometri är den bästa tekniken för att globalt profilera R-metylproteomet, när det kopplas till biokemiska metoder för modifierad peptidanrikning. Arbetsflödet som är utformat för högkonfidensidentifiering av global R-metylering i mänskliga celler beskrivs här.
Protein arginin (R)-metylering är ett utbrett protein post-translationell modifiering (PTM) som är involverat i regleringen av flera cellulära vägar, inklusive RNA-bearbetning, signaltransduktion, DNA-skaderespons, miRNA-biogenes och översättning.
Under de senaste åren, tack vare biokemisk och analytisk utveckling, har masspektrometri (MS) -baserad proteomik framstått som den mest effektiva strategin för att karakterisera det cellulära metylproteomet med enplatsupplösning. Identifiering och profilering av in vivo-protein R-metylering med MS är dock fortfarande utmanande och felbenägen, främst på grund av den substoichiometriska karaktären hos denna modifiering och närvaron av olika aminosyrasubstitutioner och kemisk metylförestring av sura rester som är isobariska för metylering. Således krävs anrikningsmetoder för att förbättra identifieringen av R-metylpeptider och ortogonala valideringsstrategier för att minska falska upptäcktshastigheter (FDR) i metylproteomikstudier.
Här beskrivs ett protokoll som är speciellt utformat för identifiering och kvantifiering av R-metylpeptider med hög konfidens från cellulära prover, som kopplar samman metabolisk märkning av celler med tungt isotopkodat metionin (hmSILAC) och dubbel proteas i lösningsuppslutning av helcellsextrakt, följt av off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) kromatografifraktionering och affinitetsanrikning av R-metylpeptider med användning av anti-pan-R-metylantikroppar. Vid högupplöst MS-analys bearbetas rådata först med MaxQuant-programvarupaketet och resultaten analyseras sedan av hmSEEKER, en programvara som är utformad för djupgående sökning av MS-topppar som motsvarar lätt och tung metylpeptid i MaxQuant-utdatafilerna.
Arginin (R)-metylering är en post translationell modifiering (PTM) som dekorerar cirka 1% av däggdjursproteomet1. Protein argininmetyltransferaser (PRMT) är de enzymer som katalyserar R-metyleringsreaktion genom avsättning av en eller två metylgrupper till kväve (N) -atomerna i guanidinogruppen i sidokedjan av R på ett symmetriskt eller asymmetriskt sätt. Hos däggdjur kan PRMT grupperas i tre klasser – typ I, typ II och typ III – beroende på deras förmåga att deponera både monometylering (MMA) och asymmetrisk dimetylering (ADMA), MMA och symmetrisk dimetylering (SDMA) eller endast MMA respektive 2,3. PRMTs riktar sig främst mot R-rester som ligger inom glycin- och argininrika regioner, så kallade GAR-motiv, men vissa PRMT, såsom PRMT5 och CARM1, kan metylera prolin-glycin-metioninrika (PGM) motiv4. R-metylering har framträtt som en proteinmodulator för flera biologiska processer, såsom RNA-skarvning5, DNA-reparation6, miRNA-biogenes7 och översättning2, vilket främjar forskningen om denna PTM.
Masspektrometri (MS) är erkänd som den mest effektiva tekniken för att systematiskt studera global R-metylering vid protein-, peptid- och platsupplösning. Denna PTM kräver dock vissa särskilda försiktighetsåtgärder för att den ska kunna identifieras med hög konfidens av medlemsstaterna. För det första är R-metylering substoichiometrisk, med den omodifierade formen av peptiderna som är mycket rikligare än de modifierade, så att masspektrometrar som arbetar i DDA-läget (Data Dependent Acquisition) kommer att fragmentera högintensiva omodifierade peptider oftare än deras metylerade motsvarigheter med lägre intensitet8. Dessutom lider de flesta MS-baserade arbetsflöden för R-metylerad platsidentifiering av begränsningar på bioinformatisk analysnivå. Faktum är att beräkningsidentifieringen av metylpeptider är benägen för höga falska upptäcktshastigheter (FDR), eftersom denna PTM är isobarisk för olika aminosyrasubstitutioner (t.ex. glycin i alanin) och kemisk modifiering, såsom metylförestring av aspartat och glutamat9. Därför har metoder baserade på isotopmärkning av metylgrupper, såsom tung metylstabil isotopmärkning med aminosyror i cellodling (hmSILAC), implementerats som ortogonala strategier för säker MS-identifiering av de vivo-metyleringar, vilket avsevärt minskar frekvensen av falska positiva anteckningar10.
Nyligen har olika proteomomfattande protokoll för att studera R-metylerade proteiner optimerats. Utvecklingen av antikroppsbaserade strategier för immunaffinitetsberikning av R-metylpeptider har lett till annotering av flera hundra R-metylerade platser i humana celler11,12. Dessutom rapporterade många studier 3,13 att koppling av antikroppsbaserad anrikning med peptidseparationstekniker såsom HpH-RP-kromatografifraktionering kan öka det totala antalet identifierade metylpeptider.
Denna artikel beskriver en experimentell strategi utformad för systematisk och hög konfidensidentifiering av R-metylerade platser i mänskliga celler, baserat på olika biokemiska och analytiska steg: proteinextraktion från hmSILAC-märkta celler, parallell dubbel enzymatisk matsmältning med trypsin- och lysarginasproteaser, följt av HpH-RP-kromatografisk fraktionering av smälta peptider, i kombination med antikroppsbaserad immunaffinitetsberikning av MMA-, SDMA-, och ADMA-innehållande peptider. Alla affinitetsberikade peptider analyseras sedan med högupplöst vätskekromatografi (LC)-MS/MS i DDA-läge, och råa MS-data bearbetas av MaxQuant-algoritmen för identifiering av R-metylpeptider. Slutligen bearbetas MaxQuant-utdataresultaten med hmSEEKER, ett egenutvecklat bioinformatikverktyg för att söka par av tunga och lätta metylpeptider. Kortfattat läser och filtrerar hmSEEKER metylpeptididentifieringar från msms-filen, matchar sedan varje metylpeptid till dess motsvarande MS1-topp i allPeptides-filen och söker slutligen toppen av den tunga / lätta peptidmotparten. För varje förmodat tungt lätt par beräknas parametrarna Log2 H/L-förhållande (LogRatio), Retention Time difference (dRT) och Mass Error (ME) och dubbletter som finns inom användardefinierade cut-offs märks som sanna positiva. Arbetsflödet för det biokemiska protokollet beskrivs i figur 1.
Den höga konfidensidentifieringen av in vivo-protein / peptidmetylering genom global MS-baserad proteomik är utmanande på grund av risken för hög FDR, med flera aminosyrasubstitutioner och metylförestring som inträffar under provberedning som är isobarisk för metylering och kan orsaka felaktiga uppdrag i avsaknad av ortogonala MS-valideringsstrategier. Den substoichiometriska karaktären hos denna PTM komplicerar ytterligare uppgiften för global metylproteomik, men kan övervinnas med selektiv anriknin…
The authors have nothing to disclose.
MM och EM är doktorander inom European School of Molecular Medicine (SEMM). EM är mottagare av ett 3-årigt FIRC-AIRC-stipendium (projektkod: 22506). Globala analyser av R-metylproteomer i TB-gruppen stöds av AIRC IG Grant (Project Code: 21834).
Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |