CRISPR/Cas9 게놈 편집을 위한 옥수수 Planthopper, Peregrinus maidis, 배아의 미세주입

Summary

여기에서는 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집을 통해 게놈을 수정하거나 생식계열 형질전환을 통해 표시된 전치 요소를 추가할 목적으로 세포 전 옥수수 식물 호퍼 배아를 수집하고 미세 주입하기 위한 프로토콜입니다.

Abstract

옥수수 재배자 인 Peregrinus maidis는 옥수수의 해충이며 여러 옥수수 바이러스의 매개체입니다. 이전에 발표된 방법은 애벌레와 성체에 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 미세 주입하여 P. maidis에서 RNA 간섭(RNAi)을 유발하는 것을 설명합니다. RNAi의 힘에도 불구하고 이 기술을 통해 생성된 표현형은 일시적이며 장기적인 멘델 유전이 부족합니다. 따라서 P. maidis 도구 상자는 안정적인 돌연변이 균주를 생산할 수 있는 기능적 게놈 도구를 포함하도록 확장되어야 하며, 연구자들이 경제적으로 중요한 이 해충에 대한 새로운 방제 방법을 도입할 수 있는 문을 열어야 합니다. 그러나 RNAi에 사용되는 dsRNA와 달리 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집 및 생식계열 형질전환에 사용되는 성분은 세포막을 쉽게 통과하지 못합니다. 결과적으로 플라스미드 DNA, RNA 및/또는 단백질은 배아가 세포화되기 전에 배아에 미세 주입되어야 하므로 주입 시기가 성공에 중요한 요소입니다. 이를 위해 비교적 짧은 간격으로 P. maidis 암컷에서 배아를 수확할 수 있도록 아가로오스 기반 알을 낳는 방법이 개발되었습니다. 여기에서는 CRISPR 성분(가이드 RNA와 복합체가 있는 Cas9 뉴클레아제)이 있는 전세포 P. maidis 배아를 수집 및 미세주입하기 위한 자세한 프로토콜을 제공하며, P. maidis 눈 색깔 유전자(흰색)의 Cas9 기반 유전자 knockout 결과를 제시합니다. 이러한 프로토콜은 P. maidis에서 CRISPR/Cas9-게놈 편집을 설명하지만, 단순히 주입 용액의 구성을 변경하여 생식계열 형질전환을 통해 형질전환 P. maidis를 생산하는 데에도 사용할 수 있습니다.

Introduction

옥수수 재배자 인 Peregrinus maidis는 옥수수 ^1,2,3의 경제적으로 중요한 해충입니다. 그들은 피어싱을 빨아들이는 입 부분을 먹이는 동안과 배아를 식물 조직에 직접 낳을 때 번식하는 동안 식물에 직접적인 물리적 손상을 일으킵니다 ^2,4. 농작물에 직접적인 피해를 입히는 여러 경로에도 불구하고 이 곤충이 작물 건강에 미치는 가장 큰 영향은 옥수수 모자이크 바이러스(MMV)와 옥수수 줄무늬 바이러스의 매개체 역할을 함으로써 간접적입니다 ^5,6. MMV는 P. maidis 벡터의 몸에서 복제할 수 있어 바이러스가 평생 동안 개별 곤충에서 지속될 수 있으므로 새로운 숙주 식물에 바이러스를 계속 퍼뜨릴 수 있습니다 ^7,8. P. maidis를 방제하는 가장 일반적인 방법은 살충제입니다.

안타깝게도 이러한 제품의 잘못된 관리로 인해 대상 해충에 대한 저항성이 발생하고 환경 오염이 발생했습니다⁹. 따라서 이 곤충/바이러스-해충 조합으로 인한 작물 손실을 줄이기 위한 새로운 전략이 필요합니다. 이전 연구에서는 RNA 간섭(RNAi)이 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 섭취할 때에도 유전자 발현의 하향 조절에 취약하기 때문에 P. maidis에 대한 효과적인 제어 방법이 될 수 있음을 입증했습니다¹⁰. 그러나 현장에서 dsRNA를 투여하는 가장 효과적인 방법은 곤충이 먹는 식물을 통하는 것입니다. 따라서 작물은 곤충이 이미 가지고 있는 바이러스에 여전히 취약할 수 있습니다. CRISPR/Cas9 게놈 편집의 출현으로 Cas9 기반 유전자 드라이브^11,12를 포함한 새로운 해충 방제 전략이 가능해졌으며, 이는 해충 개체군의 크기를 줄이거나 해당 개체군을 벡터가 되는 바이러스에 내성이 있는 개체로 대체하는 데 사용할 수 있습니다.

그러나 모든 유형의 유전자 구동 시스템의 개발 및 배치에는 형질전환 기술의 개발이 필요합니다. 이러한 방법은 P. maidis ^10,13에서 RNAi의 효율로 인해 dsRNA 및/또는 siRNA가 세포막을 통과할 수 있는 것으로 추정되기 때문에 P. maidis에서 RNAi 실험을 수행하는 데 필요하지 않았습니다. 이는 전통적인 형질전환 또는 Cas9 기반 유전자 편집에 사용되는 DNA 및/또는 단백질에는 해당되지 않으며, 둘 중 하나는 유전자 드라이브를 운반하는 곤충을 만드는 선구자가 될 것입니다. 유전자 편집 또는 다른 형태의 생식계열 형질전환을 달성하기 위해 이러한 DNA와 단백질은 곤충 배아가 세포화되기 전인 세포융합 배반엽 단계에서 배아에 이상적으로 미세 주입됩니다. syncytial 단계는 발달의 초기 부분이기 때문에 타이밍이 중요합니다^14,15. P. maidis 암컷은 우선적으로 식물 조직에 알을 낳기 때문에 미세 주입을 위해 충분한 양의 세포전 배아를 추출하는 것은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 따라서 세포화 전에 P. maidis 배아를 신속하게 수집하고 미세 주입하는 새로운 기술이 개발되었습니다.

Protocol

1. P. maidis 성인의 식민지 수준 양육 사육 케이지 당 주당 최소 4 개의 옥수수 화분을 심고 화분 당 3-4 개의 씨앗을 심습니다. 곤충이 없는 환경에서 자랍니다. 식물이 ~ 5 주 된 경우 30cm x 30cm x 60cm 케이지 안에 넣습니다. 연구실이나 야생에서 충분한 양의 P. maidis 성충(~500)을 구하여 9-12개의 옥수수 식물(화분 3-4개)이 있는 방충 케이지에 넣습니다. 곤충 사육 인큐베이터에서 25 ° C (± 1 ° C)의 콜로니를 70 % 이상의 습도와 14:10의 빛주기로 유지하십시오. 연령 보정된 군체를 생성하려면 알을 낳은 지 4일 후에 모든 초기 성체를 제거하고 새장에 놓인 배아가 부화하고 자연적으로 노화되도록 합니다. 5주 된 P. maidis 곤충(성충)을 흡인기로 수집하여 매주 계대 배양을 위해 신선한 옥수수 식물로 옮깁니다(그림 1). 그런 다음 신선한 옥수수 식물이 있는 깨끗한 새장에 성인을 풀어줍니다. 실험 목적으로 젊은 성인의 꾸준한 공급을 유지하려면 매주 신선한 연령 보정 케이지를 준비하십시오. 새장에 있는 화분에 하루에 두 번 물을 줍니다. 주기적으로 줄기를 자르고, 썩어가는 식물 재료를 제거하고, 필요에 따라 신선한 옥수수 화분으로 교체하십시오.참고: 적절한 유지 관리를 통해 식민지는 ~5주 동안 지속될 수 있습니다(즉, 새장에 놓인 배아가 성체가 될 수 있을 만큼 충분히 길다). 2. 아가로스 기반 알을 낳는 챔버 깨끗한 100mm x 15mm 페트리 접시에 물에 1% w/v 아가로스를 부어 계란 수집 접시(산란 배지)를 만듭니다. 산란 배지가 굳은 후 4°C에서 보관하십시오. 성인에게 먹이를 주기 위해 10% w/v 자당 용액을 준비합니다. 자당 용액을 -20°C에서 최대 한 달 동안 보관합니다. 1온스 컵의 바닥에 구멍을 뚫고( 재료 표 참조) 공기 교환을 위해 구멍 위에 스크린을 붙임으로써 성인을 수용할 수 있는 방을 만듭니다(그림 2). 플라스틱 파라핀 왁스 필름을 5cm x 5cm 정사각형으로 자릅니다. 각 컵에 2개의 사각형을 따로 보관하십시오. 연령 보정된 P. maidis 군체에서 ~15마리의 1주령 성인 암컷을 수집합니다. 암컷을 선택하려면 복부의 복부 쪽을 검사하고 일반적으로 복부의 나머지 부분보다 어두운 산란관을 찾으십시오(그림 3). 여러 개의 알을 낳는 방을 설치하는 경우 15mL 원뿔형 바이알에 성인을 최대 1시간 동안 담급니다. 섹스하기 전에 얼음 위에서 곤충을 잠시 식히고 성인 용기로 옮깁니다.참고: 이 검사는 현미경 없이 수행할 수 있습니다. 먹이를 먹고 짝짓기를 할 시간이 있는 성인 암컷은 일반적으로 성인 수컷보다 복부가 더 크고 더 유순합니다. 따라서 케이지 개체군에서 더 쉽게 선택할 수 있습니다. 암컷을 성인용 용기에 옮기고 원래 크기의 3-4배에 고르게 늘려 플라스틱 파라핀 왁스 필름 1겹으로 컵을 밀봉합니다(그림 4A, B). 플라스틱 파라핀 왁스 필름 씰 상단에 400μL의 10% w/v 자당 용액을 바르고 플라스틱 파라핀 왁스 필름의 두 번째 층을 추가하여 플라스틱 파라핀 왁스 필름을 위와 같이 정확히 늘립니다(그림 4C, D).참고: 늘어난 플라스틱 파라핀 왁스 필름 샌드위치는 자당 용액에 압력을 가하는데, 이는 성충 수유에 매우 중요하지만 암컷이 산란관을 산란 배지까지 관통하는 것을 막지는 못합니다. 플라스틱 파라핀 왁스 필름 면이 산란 배지에 직접 있는 난자 수집 접시에 성체 챔버를 놓고 공기 교환에 필요하므로 공기 구멍을 덮지 않고 전체 알을 낳는 챔버를 플라스틱 랩으로 감쌉니다(그림 5). 각 알을 낳는 챔버를 25°C에서 70% 습도와 14:10 광 주기로 배양합니다. 플라스틱 파라핀 왁스 필름과 10% w/v 자당 용액으로 샌드위치를 매일 교체하고 컵 내부에 쌓인 물을 제거합니다. 3. 고습도 환경에서의 배아 수집 및 정렬 가습 공간 또는 후드(humidified hood; 그림 6) 작업 환경이 미세 주입 공정 전반에 걸쳐 최소 70%의 습도를 달성하도록 합니다. 원하는 알을 낳는 기간 후에 산란 배지에서 알을 확인하십시오. 가습된 후드나 다른 습한 환경에서 이 작업을 수행하십시오.참고: 일반적으로 사용되는 알을 낳는 기간은 오후 6시부터 오전 10시까지 밤새 ~16시간 동안 지속되었습니다. 아가로스에 알이 놓여 있으면 미세한 집게를 사용하여 조심스럽게 파낸 다음 아가로스 표면에 놓아 촉촉하게 유지합니다(그림 7A). 22mm x 30mm 커버슬립에 1mm x 15mm 양면 테이프 스트립을 붙입니다(그림 7B). 커버슬립 테이프면이 위로 향하게 하여 산란 배지에 놓습니다(그림 7C). 한천 표면에서 각 달걀을 집어 들고 미세한 브러시를 사용하여 양면 테이프로 이동합니다. 완전히 흰색이거나 검은색을 띤 계란을 제거하십시오. 건강한 계란은 반투명합니다. 바나나 모양의 달걀을 옆으로 눕히고 큰 쪽 끝을 양면 테이프에 붙입니다(그림 7D).알림: 계란은 항상 바닥에 1% 한천 층이 있는 페트리 접시와 같이 습도가 높은 환경에 보관하십시오. 4. CRISPR 시약 및 주사바늘의 제조 Flaming/Brown 유형 마이크로피펫 풀러를 사용하여 석영 바늘을 당깁니다. 마이크로피펫 베벨러를 사용하여 석영 바늘을 베벨링합니다. 양면 접착 테이프를 사용하여 당겨진 바늘을 페트리 접시와 같은 투명한 용기에 사용할 준비가 될 때까지 고정합니다. 0.5 μL의 Cas9 단백질(5 μg/μL 원액)과 0.5 μL의 sgRNA(4 μg/μL 원액, 재료 표 참조)를 1 μL의 페놀 레드 완충액과 결합하여 최종 부피 5 μL의 주입액을 준비합니다. 바늘을 막을 수 있는 입자를 침전시키려면 용액을 잠시 와동시키고 최대 속도로 3분 동안 원심분리합니다. 주사 바늘을 다시 채우고 주사 혼합물이 바늘의 가늘어지는 끝 근처에 두도록 주의하십시오. 바늘 끝에서 기포가 있는 경우 제거합니다. 백필 바늘을 바늘 홀더에 조심스럽게 넣고 스테인리스 스틸 칼라를 조여 미세 주입 중에 바늘을 제자리에 단단히 고정합니다. 미세한 축축한 페인트 브러시로 비스듬한 팁을 부드럽게 쓰다듬어 바늘에서 안정적인 주입 용액 흐름을 생성하는 동시에 주입 시스템으로 바늘에 공기 압력을 가합니다.알림: 주사 혼합물이 팁을 소량으로 남길 수 있을 때 바늘을 주입할 준비가 된 것입니다. 5. 미세 주입 및 주사 후 관리 깨끗한 100mm x 15mm 페트리 접시에 1% 한천을 채워 접시 상단과 같은 높이의 한천의 수평 층을 형성하여 미세주입 플랫폼을 준비합니다. ~25개의 배아가 있는 미리 준비된 커버슬립을 한천 플랫폼에 놓습니다(그림 8A).알림: 모든 주입 단계는 가습 후드(~70% 습도) 내부에서 수행해야 합니다. 바늘 끝을 물 한 방울에 넣고 주입 주기를 시작하여 주입 압력을 확인합니다.알림: 압력 설정이 올바른 경우 소량의 주입 용액이 물에 분산되어야 합니다(그림 8B). 커버슬립의 왼쪽에서 접근하는 배아의 더 큰 쪽 끝에 바늘을 삽입합니다(그림 8C). 주사액을 계란에 넣고 바늘을 빨리 빼냅니다. 모든 계란을 주입한 후 덮개 슬립을 새 1% 한천 접시 표면에 놓고 접시를 습도 챔버로 옮깁니다(그림 9). 6. 배아의 부화 및 부화 부화 챔버를 25°C 인큐베이터에 6일 동안 넣었다. 깨끗한 물과 미세한 브러시를 사용하여 살아남은 배아를 접시 바닥을 덮는 물에 적신 여과지가 있는 35mm x 10mm 페트리 접시에 옮깁니다. 플라스틱 파라핀 왁스 필름으로 페트리 접시를 밀봉하고 배아가 부화할 수 있도록 25°C에서 유지합니다. 생존을 위해 주사 후 6 일 동안 배아를 확인하기 시작합니다.참고: 첫 번째 별자리 님프는 8일경에 부화를 시작합니다. 가는 브러시를 사용하여 님프를 잎사귀가 들어있는 페트리 접시에 옮깁니다. 접시를 덮고 플라스틱 파라핀 왁스 필름으로 밀봉하십시오. 부화한 새끼의 밀봉된 접시를 25°C에서 48시간 동안 잎 절단에 배양합니다. 2 일 된 모든 님프를 주사 라운드에서 옥수수 식물이있는 사육장으로 미세한 브러시를 사용하여 옮깁니다. 가시적 표현형을 가진 주사체가 충분한 수로 회복되면 다음 세대에서 표적 형질의 회복을 극대화하기 위해 별도로 후방화합니다. 그렇지 않으면 모든 주입자의 대량 결합을 수행하십시오.알림: 갓 부화한 새끼를 옥수수 식물의 소용돌이에 부드럽게 넣어 피난처를 제공하고 주변 환경의 적절한 습도를 보장합니다. 위에서 설명한 조건에서 곤충을 기르고 적절한 온도, 습도 및 신선한 옥수수 식물로의 정기적 인 이동을 보장하십시오. 예상되는 표현형에 대한 스크리닝 자손. 원하는 표현형을 나타내는 개체를 자신의 케이지에 배치하여 동형 접합 라인을 설정합니다.

Representative Results

알을 낳는 방은 P. maidis 암컷이 알을 쉽게 회수할 수 있는 보호 배지에서 산란하면서 먹이를 먹을 수 있도록 특별히 설계되었습니다. 이 방법을 사용하여 DNA, RNA 및/또는 단백질로 미세주입하기 위해 충분한 양의 세포전 배아를 회수했습니다. 성체 P. maidis 암컷은 일반적으로 옥수수 식물의 잎 조직 내부에 알을 낳기 때문에 많은 잎 해부가 필요하기 때문에 짧은 시간에 충분한 알을 얻는 것이 어렵습니다. 인공 알을 낳는 환경은 이러한 문제를 극복할 수 있는 솔루션을 제공합니다. 표 1에 나타난 바와 같이, 4주 동안 총 645마리의 암컷으로부터 6,483개의 알을 채취하였다. 암컷은 일반적으로 2일 이후에 알을 낳기 시작하고 4일차에서 6일차까지 대부분의 알을 낳습니다. 산란 활동은 9 일째까지 느려졌습니다. 각 산란실은 금요일에 설치되었고 일요일부터 다음 일요일까지 알을 확인했습니다. 이 일정에 따라 일주일 동안 미세 주사를 위해 대부분의 난자를 수집할 수 있었습니다. 이 알을 낳는 시스템의 첫 번째 실제 적용은 눈 색깔 유전자인 백색(Pmw)의 P. maidis ortholog를 표적으로 사용하여 Cas9 매개 유전자 knockout의 효능을 테스트하는 것이었습니다. 백색의 돌연변이는 다른 곤충 종에서 눈 색소 침착의 상당한 손실을 초래하는 것으로 알려져 있으며, 백색은 세포 자율적이어서 주사 된 개체에서 돌연변이를 검출 할 수 있습니다16,17. 작은 돌연변이라도 기능 상실을 초래할 가능성을 높이기 위해 가이드 RNA는 백색 기능16에 필요한 ATP 결합 카세트의 영역 내에서 절단하도록 설계되었습니다. P. maidis 배아에 20% 페놀 레드(주입 완충액), 최종 농도 800ng/μL의 Cas9 주입 완충액(Cas9 대조군) 또는 주입 완충액에 Cas9와 각각 400ng/μL 농도의 가이드 RNA를 3개 첨가하여 주입했습니다. 하나의 주입 혼합물 내에서 3개의 가이드를 조합하는 것은 큰 결실을 생성하고 하나의 가이드가 절단에 효과적이지 않을 가능성을 보상함으로써 돌연변이를 생성할 가능성을 더욱 극대화하기 위한 것이었습니다. 각 치료의 발달률은 비슷했으며(표 2), 주사된 개인의 50-60%가 발달 징후를 보였습니다. 버퍼와 Cas9 대조군의 해치율도 비슷했습니다. 그러나 3 가이드 믹스를받는 개인의 부화율은 상대적으로 낮았다. 현재로서는 생존율 감소가 백색 기능 상실의 결과인지 아니면 표적 이탈 효과와 같은 3-가이드 혼합의 의도하지 않은 결과의 결과인지는 불분명합니다(토론 섹션 참조). 그러나 눈 색소 침착이 완전히 상실된(즉, 완전한 녹아웃) 개체는 부화하지 않았으며 주사된 개체의 자손 중 누구도 흰색 눈을 갖지 않았습니다. Cas9 기반 돌연변이 유발의 표적 효능은 두 가지 방법으로 검증되었습니다. 먼저, 주사자는 눈 색소 침착의 상실에 대해 스크리닝되었습니다. 발달한 71명의 가이드 주사 개체 중 23명이 어느 정도의 색소 손실을 보였고(그림 10), 그 중 9명이 부화하여 ≥32%의 녹아웃률을 보였습니다. 두 대조군 치료에서 눈 색소 손실은 관찰되지 않았습니다. 둘째, 중합효소연쇄반응(PCR)18 과 시퀀싱(sequencing)19을 통해 염색체 돌연변이를 확인하였다. 돌연변이 계통을 회수할 수 없었기 때문에 3-가이드 믹스 또는 완충액이 주입된 배아 풀에서 게놈 DNA를 분석했습니다. 3 가이드 믹스는 흰색 궤적에서 ~ 180 염기쌍을 제거 할 것으로 예상됩니다. 이는 주입된 개인으로부터 분리된 게놈 DNA에서 증폭된 PCR 산물과 해당 산물에서 생성된 관련 서열 데이터에서 볼 수 있습니다(그림 11). 이 결합된 증거는 세포화가 일어나기 전에 배아가 주입되었음을 나타냅니다. 그림 1: 흡인기. 효과적인 흡인기는 플라스틱 튜브를 통해 흡입구에 진공 펌프를 부착하여 15mL 플라스틱 원뿔형 튜브에 조립할 수 있습니다. 원추형 튜브의 바닥에서 약 0.5cm를 조심스럽게 제거해야합니다. 솜뭉치를 플라스틱 튜브의 입구 위의 원뿔형 튜브에 넣어 P. maidis 성인이 수집될 때 잡아서 진공 펌프에서 꺼내야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2 : 성인 컨테이너의 구성. (A) 필요한 소모품(왼쪽 상단에서 시계 방향): 스크린, 핫 글루건, 면도날, 1온스 용기. (B) 1온스 용기의 바닥에 큰 구멍을 뚫고 이 구멍을 덮을 만큼만 정사각형의 스크린을 잘라야 합니다. (C) 그런 다음 뜨거운 접착제를 사용하여 스크린을 구멍 위에 접착합니다. (D) 접착제가 굳으면 여분의 메쉬를 제거해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3 : 성관계 P. maidis 성인. 수컷 (왼쪽)과 암컷 (오른쪽) P. maidis 성인의 복부 측면이 표시됩니다. 여성 복부에서 볼 수있는 산란관은 개인의 성별을 가장 명확하게 나타내는 지표입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 성인을 용기에 밀봉합니다 . (A) 5cm x 5cm 정사각형의 플라스틱 파라핀 왁스 필름. (B) 필름은 원래 크기의 3-4배까지 고르게 늘려야 합니다. (C) 성인이 성인용 용기에 넣은 후에는 성인을 고정하기 위해 개구부 위에 늘어난 필름을 놓아야 합니다. 그런 다음 10% w/v 자당 용액 400μL 방울을 필름 위에 놓아야 합니다. (D) 성인에게 적절한 수유 압력을 제공하기 위해 두 번째 5cm x 5cm 정사각형의 플라스틱 파라핀 필름을 유사하게 늘려서 자당 방울 위에 놓아야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5 : 산란 챔버 설정. (A) 필요한 용품(왼쪽 상단부터 시계 방향): 플라스틱 랩, 완성된 성인용 용기(성인용 포함), 1% 아가로스가 함유된 페트리 접시(산란 배지). (B) 성체 용기는 플라스틱 파라핀 필름/10% 자당 ‘샌드위치’를 산란 배지에 직접 놓고 아가로스 위에 놓아야 합니다. (C) 플라스틱 랩은 성인 용기를 산란 배지에 고정하는 데 사용됩니다. 이렇게 하면 매체가 너무 빨리 건조되는 것을 방지할 수 있습니다. (D) 공기 교환이 계속될 수 있도록 성인용 컨테이너의 스크린을 가리지 않도록 주의해야 합니다. (E) 산란 챔버의 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 6: 가습 후드. 가습기가 장착된 후드는 배아를 처리하는 동안 공기 외풍을 최소화하고 습도를 유지하기 위해 주입 스코프 주위에 설치되었습니다. 작업자가 자리를 잡은 후 입구 위로 플랩을 접어 적절한 습도 수준을 유지할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 7: 주사 준비를 위한 배아 수집. (A) 산란 배지에 침착된 배아. 한 쌍의 미세한 집게를 사용하여 배지에서 배아를 추출하여 표면에 놓습니다. (B) 22mm x 30mm 커버슬립에 1mm x 15mm 양면 테이프로 된 좁은 스트립. (C) 커버슬립은 배지 표면에서 커버슬립의 테이프로 배아를 쉽게 이식할 수 있도록 산란 배지 위에 놓을 수 있습니다. (D) P. maidis 배아는 바나나 모양이며 한쪽 끝이 다른 쪽 끝보다 좁습니다(좁은 끝은 빨간색 화살촉으로 표시됨, 넓은 끝은 노란색 화살촉으로 표시됨). 배아의 넓은 끝은 테이프에 놓아야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 8: 주입. (A) 주입 플랫폼은 1% 한천으로 가장자리에 채워진 페트리 접시입니다. 배아를 담는 테이프 스트립이 있는 커버슬립은 주입 플랫폼의 표면에 직접 놓아야 합니다. (B) 배아를 주입하기 전에 소량의 주사액을 물 한 방울에 ‘주입’하여 주입 압력을 테스트해야 합니다. 이 방법은 주사 과정 중 언제든지 바늘에 막힘이 있는지 확인하는 데 사용할 수도 있습니다. (C) 배아는 배아의 큰 쪽 끝에 바늘을 삽입하여 주입해야 합니다. 주입이 성공한 경우 주입 용액이 보여야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 9: 주사 후 관리 . (A) 커버슬립의 모든 배아가 주입되면 커버슬립을 1% 아가로스가 함유된 신선한 페트리 접시에 넣어야 합니다. (B) 커버슬립이 있는 페트리 접시는 배아가 부화할 때까지 습도 챔버(그림과 같은)에 보관할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 10: Pmw 녹아웃 표현형. (A) 연령 일치 대조군 및 (B) 검은색 화살촉으로 표시된 발달 중인 눈이 있는 Pmw 녹아웃 배아. B 의 배아는 모자이크이며 작은 색소 침착 줄무늬를 볼 수 있습니다. (C) 연령 일치 대조군 및 (D) Pmw 녹아웃 부화, 삽입물이 눈에 다른 각도를 보여줍니다. D 의 새끼도 모자이크입니다. 흰색 화살표는 메인 사진에서 색소 침착 상실을 나타내는 영역을 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 11: Pmw 녹아웃 시퀀스. (A) gRNA 결합 부위의 위치가 표시된 500bp 단위로 표시된 Pmw mRNA의 축척 모델: G1, 파란색; G2, 노란색; G3, 핑크. 이 시점에서 생성된 프레임 시프트 돌연변이는 대부분의 번역 제품을 방해합니다. (B) gRNA 부위의 게놈 맥락, 모두 하나의 엑손(굵은 대문자 텍스트). 가이드 바인딩 부위는 A와 같은 색으로 강조 표시되고 PAM에는 밑줄이 그어집니다. 스팬은 ~ 300 bp입니다. 엑손의 프레임 내 번역은 대문자로 된 한 글자 약어로 위에 나와 있습니다. 눈 색소 수송체에 특정한 두 가지 모티프가 표시됩니다. Walker B 기능성 도메인의 CDEPT 모티프는 보라색으로 박스형으로 되어 있고, H-루프 도메인의 IHQP 모티프는 녹색으로 박스형으로 되어 있다. 두 영역 모두 ATP 수송체 기능에 중요합니다. (C) Pmw 표적 영역은 2라운드의 PCR을 사용하여 증폭되었습니다. 두 번째 라운드 제품은 가이드 사이의 영역을 성공적으로 제거하여 크기 이동의 증거를 확인하기 위해 젤에서 검사되었습니다. 차선: L = 100bp 사다리; 1 = PCR 물 조절; 2 = 완충액 주입 계란; 3-4 = 3 가이드 믹스로 주입 된 두 세트의 계란. 3-가이드 믹스를 받은 배아만이 WT 밴드(빨간색 화살표)와 완전한 절제(흰색 화살표)로 인한 밴드를 모두 생성했습니다. (D) 아래쪽(흰색 화살표) 밴드의 정체를 확인하기 위해 이 DNA를 정제, 복제 및 시퀀싱했습니다. 맨 윗줄은 야생형 시퀀스입니다. 다른 두 줄은 두 클론의 시퀀스입니다. 3개의 추가 클론이 하단 서열과 일치했습니다. 파란색 강조 표시는 가이드 1의 바인딩 위치를 나타내고 분홍색 강조 표시는 가이드 3의 바인딩 위치를 나타냅니다. 두 대립 유전자 모두에서 이 두 가이드 부위 사이의 전체 영역이 삭제되었습니다. 약어: Pmw = Peregrinus maidis white gene; gRNA = 가이드 RNA; PAM = protospacer 인접 모티프; ATP = 아데노신 삼인산; PCR = 중합효소 연쇄반응; WT = 야생형; KO = 녹아웃. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 집합 # 컵 수 # 각 컵에 있는 여성의 수 # 달걀 계란의 총 # 2일차 3일차 4일차 5일차 6일차 7일차 8일차 9일차 1 10 15 0 26 166 355 530 193 91 37 1398 2 15 15 22 238 489 699 520 379 203 58 2608 3 8 15 0 57 230 190 116 80 34 1 708 4 10 15 0 226 446 519 301 179 24 15 1710 합계 43 15 23 547 1331 1763 1467 831 352 111 6483 표 1 : 인공 산란 환경에서 대표적인 난자 수집. 4세트의 달걀 채취 컵의 데이터가 표시되며, 달걀 집계는 설정 후 2일째부터 시작하여 9일째까지 실행됩니다. 주사 치료 총 주입 총 개발 총 부화 개발률(%) 해치율(%) 완충기 39 20 12 51 31 캐스9 39 24 14 61 36 Cas9 +Pmw gRNA 121 71 28 59 28 표 2: 3가지 다른 주사 혼합물의 주사로 인한 생존율 및 녹아웃률.

Discussion

알을 낳는 품질과 영양
최근 관련 종인 닐라파르바타 루겐스(Nilaparvata lugens)를 연구하는 연구자들은 잎에서 직접 미세 주입에 사용한 알을 얻어 부화할 때까지 주입된 알을 잎 조직에 보관했습니다¹⁷. 이 잎 기반 방법은 배아 발달을 위한 보다 자연스러운 환경을 제공했지만 제거 과정에서 감염 및 난자 손상 가능성도 높였습니다. 여기에 제시된 인공 산란 시스템은보다 균일 한 환경을 제공하고 취급으로 인한 계란 손상 가능성을 줄입니다. 금요일에 산란 컵을 설치함으로써, 산란된 알의 대부분은 미세 주입 작업을 하는 사람들의 이익을 위해 일반적인 작업 주 동안 수집되었습니다. 그러나 이 방법의 한 가지 주의 사항은 10% 자당 용액 식단의 영양소 부족이 결국 곤충의 건강에 영향을 미치고 컵에 있는 암컷은 일반적으로 단 10일 후에 죽기 시작한다는 것입니다. 계란의 품질도 6일 후에 떨어지기 시작하는데, 이는 죽거나 건강에 해로워 보이는 계란의 증가로 입증됩니다. 결과적으로, 미세 주사에 사용되는 알을 선택하고 6 일 후에 암컷을 지키지 않는 것이 중요합니다.

생존율 및 습도
두 가지 요인이 미세주입 과정을 통한 배아 생존에 중요한 것으로 보입니다. P. maidis 배아를 취급할 때 가장 어려운 점은 산란 배지에서 제거한 후 미세 주입을 통해 배아가 건조되지 않도록 하는 것입니다. 알은 일반적으로 식물 조직 내부에 낳기 때문에 탈수를 방지하기 위한 적절한 껍질이 부족합니다. 가습 된 후드에서도 건조로 인해 전체 계란 세트가 손실되었습니다. 그러나 지나치게 높은 습도는 양면 테이프나 스코프에 물이 쌓이는 경우에도 미세 주입에 영향을 줄 수 있습니다. 안타깝게도 계란 탈수는 일반적으로 미세 주입 과정에서 쉽게 알아차리지 못했고, 2-3일 후까지 완전히 투명해져서 발달의 징후가 보이지 않을 때까지 정상으로 나타나는 경우가 많았습니다.

바늘의 질도 생존에 중요한 역할을 하는 것으로 보입니다. 계란의 불필요한 손상을 최소화하기 위해 바늘을 비스듬히 세워야 합니다. 바늘이 막혔을 때 인젝터의 청소 기능을 사용하여 젖은 페인트 브러시로 바늘 끝을 부드럽게 쓰다듬으면(4.7단계 참조) 일반적으로 바늘이 기능 상태로 돌아갑니다. 그럼에도 불구하고 각 바늘에 소량의 주사액(~0.25μL)만 넣고 주사 과정 전반에 걸쳐 바늘 품질이 유지되도록 하려면 몇 번의 슬라이드(~50-60알)마다 새 바늘로 전환하는 것이 좋습니다.

녹아웃 표현형의 성공적인 생성
생식 세포를 성공적으로 변형시키려면 일반적으로 세포화 전에 가능한 한 빨리 배아 미세 주입을 수행해야 합니다. 곤충 종에 따라 미세 주입을 완료하는 데 걸리는 시간은 불과 몇 시간에서 하루^{종일 14,15,20}까지 다양합니다. P. maidis 배아가 언제 세포화를 겪는지는 아직 불분명합니다. Cas9 매개 knockout은 알을 낳은 후 4시간에서 최대 16시간까지 어린 배아에서 테스트되었으며, 모든 실험에서 예상되는 표현형이 관찰되었으며, 이는 모든 미세주입이 셀룰화 전 기간 내에 수행되었음을 시사합니다.

눈 색깔 유전자인 흰색의 P. maidis ortholog는 녹아웃 표현형이 세포 자율적 특성으로 인해 주사제에서 스크리닝하기 쉬울 것으로 예상되었기 때문에 선택되었습니다. 실제로, 예상대로, 모자이크 및 전체 녹아웃은 Cas9 및 가이드 RNA를 포함하는 주입 혼합물을 받은 배아에서 명확하게 식별할 수 있었습니다. 불행하게도, 완전한 녹아웃을 가진 주사자는 부화하지 않았으며, 살아남은 주사체의 대량 교미는 흰 눈 자손을 생성하지 못했습니다. 그러나 돌연변이 계통은 나중에 다른 유전자를 표적으로 삼아 성공적으로 생성되었습니다(Klobasa et al., 진행 중). 이는 백색 돌연변이 계통을 확립하지 못한 것이 밀접하게 연결된 치명적인 돌연변이를 생성하는 off-target 효과(즉, Cas9이 게놈의 다른 곳에서 중요한 영역을 절단함) 또는 P. maidis에서 백색에 대한 예측할 수 없는 중요한 역할 때문일 가능성이 가장 높다는 것을 시사 합니다.

표현형 및 분자 데이터(그림 8 및 그림 9)는 주입된 배아 샘플에서 백색 유전자좌의 상당한 녹아웃이 생성되어 유전자 기능이 완전히 손실되었음을 확인합니다. 더욱이 일부 종에서는 백색의 돌연변이가 생존 가능하지만 백색 활동 감소가 해로운 선례가 있습니다^21,22. 즉, 타겟 이탈 효과를 완전히 배제할 수는 없습니다. 표적을 벗어날 가능성이 있는 것을 예측하기 위해서는 정확한 게놈 염기서열 데이터(genome sequence data)²³가 필요한데, P. 마이디스(P. maidis)의 게놈 자원의 현재 상태로는 현재로서는 불가능하다. 그럼에도 불구하고 이러한 새로운 방법을 사용하면 다른 표적 유전자를 자신 있게 테스트할 수 있으며, 이 악성 해충에 새로운 유전 도구를 도입하기 위한 노력의 일환으로 보다 전통적인 형질전환으로 이동할 수도 있습니다.

Materials

1 oz Containers	Dart	P100N	Adult container for egg-laying setup
15 mL Conical Tubes	Olympus	Genesee 28-103	Serves as collection tube on vacuum aspirator setup
15 mL Conical Tubes	Olympus	Genesee 28-106	For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening
Aspirator	Bioquip	1135A	For handling planthoppers
Vacuum Aspirator	Fischer Technical	LAV-3	Vacuum for aspirating larger numbers of insects
Blue Spectrum LED Lights	Home Depot	GLP24FS/19W/LED	Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on
Cas9	TrueCut Cas9 Protein v2	A36498	Endonuclease for cutting planthopper genes
Clear Vinyl Tubing	Home Depot	3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft.	Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup
Corn planthoppers	North Carolina State University	N/A	Request from Dr. Anna Whitfield's lab
Cotton balls	Genessee	51-101	Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup
Double sided tape	Scotch Double Sided Tape	NA	Holding eggs for microinjection
Early Sunglow corn	Park Seed Company	05093-PK-N	Corn for rearing planthoppers
epTIPS Microloader Tips	Eppendorf	C2554691	Backfilling needle loading tips
Femtojet Microinjection System	Eppendorf	5247	Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size)
Nutri-Fly Drosophila Agar	Genessee	66-103	Substrate for everything except egg-laying dish
Fine forceps	Bioquip	4731	Egg handling
General Purpose LE Agarose	Apex	20-102	Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium)
Guide RNA 1 – GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)	RNA guides for targeting planthopper white gene
Guide RNA 2 – UCUGAAAUCACUGGCCAAUA	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)	RNA guides for targeting planthopper white gene
Guide RNA 3 – GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)	RNA guides for targeting planthopper white gene
Humidifyer	Homedics	UHE-CM45	For providing humidity in humidified hood
Humidity chamber	Billups-Rothenberg	MIC-101	For holding injected embryos until hatching
Insect rearing cages	Bioquip (special order)	Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides)	Cage for planthoppers on corn
Laser-based Micropipiette Puller	Sutter Instruments	P-2000/G	For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160
Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope	Leica	M165 FC	Planthopper screening
Microinjection Scope	Leica	MZ12-5	Microinjection scope outfited with an XY stage
Micromanipulator	Narishige	MN-151	For positioning microinjection needle
Micropipette beveler	Sutter Instruments	FG-BV10-D	For beveling injection needles / Used 'fine' graded plate at 20° angle
Microscope Stage	AmScope	GT100 X-Y Gliding Table	For positioning and moving embryos under microscope
Miniature Paint Brush	Testor #2 8733	Sold in 3 pack 281206	Fine paintbrushes for embryo handling
Needle Holder	Narishige	HI-7	For holding the microinjection needle
Percival Incubator	Percival	I41VLH3C8	Rearing injectees until hatch
Petri Dishes (100 x 15 mm)	VWR	89038-968	Making agar dish for egg-lay
pGEM-T Easy Vector System I cloning kit	Promega	A1360	Cloning Pm white target site
Phenol Red	Sigma	143-78-8	Microinjection buffer
Plain Microscope Slides or coverslip	Fisher Scientific	12-549-3	Hold eggs for microinjection
Plasmid DNA Midi Kit	Zymo	D4200	Purification of injection-ready plasmid DNAs
Plastic paraffin film	Pechiney Plastic Packaging	PM-996	Roll size 4 in. x 125 ft
Plastic wrap	Glad ClingWrap Plastic Wrap	NA	Wrap the entire egg-laying chamber
Primer – PmW CRISPR check F1 – AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA	IDT	25 nmole DNA Oligo	First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene
Primer – PmW CRISPR check R1 – GATTCCTCGCTGTTGGGT	IDT	25 nmole DNA Oligo	First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene
Primer – PmW CRISPR check F3 – TCACAGACCCTGGTGCTAATC	IDT	25 nmole DNA Oligo	Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene
Primer – PmW CRISPR check R3 – GTCCACAATCCACACTTCTGA	IDT	25 nmole DNA Oligo	Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene
Quartz capillaries	Sutter Instruments	QF100-50-10	For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length
Screen (White Organza Fabric)	Joann Fabrics	16023889	For covering the adult container
Sparkleen	Fisher Scientific	04-320-4	Wash dishes
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1	To make 10% sucorose solution