عزل خلايا الصمام الخلالي الماوس لدراسة تكلس الصمام الأبهري في المختبر
Summary
توضح هذه المقالة عزل خلايا الصمام الأبهري للفأرة بواسطة إجراء كولاجيناز من خطوتين. خلايا صمام الماوس المعزولة مهمة لإجراء فحوصات مختلفة، مثل هذا المقايسة تكلس المختبر، والتحقيق في المسارات الجزيئية المؤدية إلى تمعدن الصمام الأبهري.
Abstract
تكلس خلايا الصمام الأبهري هو السمة المميزة للتضيق الأبهري ويرتبط مع تليف أعتاب الصمام. تلعب الخلايا الخلالية للصمامات (VICs) دورا مهما في عملية تكلس تضيق الأبهر من خلال تفعيل برنامجها للتمايز إلى خلايا تشبه الأرومة العظمية. MOUSE VICs هي أداة جيدة في المختبر لتوضيح مسارات الإشارات التي تقود تمعدن خلية الصمام الأبهري. الطريقة الموصوفة هنا، التي استخدمها هؤلاء المؤلفون بنجاح، تشرح كيفية الحصول على خلايا معزولة حديثا. تم إجراء عملية كولاجيناز من خطوتين مع 1 ملغم/مل و4.5 ملغم/مل. الخطوة الأولى حاسمة لإزالة طبقة الخلية البطانية وتجنب أي تلوث. حضانة الكولاجين الثانية هي تسهيل هجرة VICs من الأنسجة إلى اللوحة. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة إجراء تلطيخ immunofluorescence لتوصيف النمط الظاهري لخلايا صمام الماوس المعزولة. وعلاوة على ذلك، تم إجراء فحص تكلس في المختبر باستخدام إجراء قياس كاشف الكالسيوم وتلطيخ أحمر alizarin. استخدام الخلايا صمام الماوس الثقافة الأولية أمر ضروري لاختبار أهداف الدوائية الجديدة لمنع تمعدن الخلايا في المختبر.
Introduction
مرض الصمام الأبهري المتكلس (CAVD) هو مرض القلب الصمامي الأكثر انتشارا في السكان الغربيين ، ويؤثر على ما يقرب من 2.5٪ من الأفراد المسنين الذين تزيد أعمارهم عن 65 عاما. CAVD يؤثر على أكثر من ستة ملايين أميركي ويرتبط مع التغيرات في الخصائص الميكانيكية للمنشورات التي تضعف تدفق الدم العادي من خلال1،2. حاليا، لا يوجد علاج دوائي لوقف تطور المرض أو لتنشيط الانحدار المعدني. العلاج الفعال الوحيد لعلاج CAVD هو استبدال الصمام الأبهري عن طريق الجراحة أو استبدال الصمام الأبهري عبر القسطرة3. ولذلك فمن الضروري التحقيق في الآليات الجزيئية المؤدية إلى تمعدن الصمام لتحديد أهداف دوائية جديدة. في الواقع، تضيق الأبهر غير المعالجة له عدة عواقب سلبية مثل ضعف البطين الأيسر وفشل القلب4.
يتكون الصمام الأبهري من ثلاث طبقات تعرف باسم فيروسا وسبونغيوسا والبطين ، والتي تحتوي على VICs كنوع الخلية السائد5. وتغطي فيبرسا البطين بطبقة من الخلايا البطانية الوعائية (VECs)5. تنظم VECs نفاذية الخلايا الالتهابية وكذلك إشارات الباراكورين. زيادة الإجهاد الميكانيكي قد تؤثر على سلامة VECs وتعكر صفو التوازن من الصمام الأبهري، مما يؤدي إلى غزو الخلايا الالتهابية6. أظهرت تحليلات المجهر الإلكتروني المسح الضوئي تعطل بطانة الرحم في صمام الأبهر المتكلس الإنسان7.
تكشف التحليلات النسيجية للأنسجة المتكلسة عن وجود أوبلاستات والعظام. وعلاوة على ذلك، لوحظ التمايز العظمي للمركبات VICs في المختبر وفي أنسجة الصمام البشري8. يتم تنظيم هذه العملية بشكل رئيسي من قبل عامل النسخ المرتبط رونت 2 (Runx2) والبروتينات مورفوجينية العظام (BMPs)8،9.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه المقالة بروتوكول مفصل عزل خلية صمام الماوس للثقافة الأساسية. تم تجميع ثلاثة صمامات الأبهر من الفئران البالغة من العمر 8 أسابيع للحصول على عدد كاف من الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول توصيف النمط الظاهري في مركز فيينا الدولي ومقايسة التمعدن في المختبر. تم تك…
Materials
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
- Rostagno, C. Heart valve disease in elderly. World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).
- Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P. Medical treatment of aortic stenosis. Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).
- Spitzer, E., et al. Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials. Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering. Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).
- Bouchareb, R., et al. Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis. European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).
- Rutkovskiy, A., et al. Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification. Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Richards, J., et al. Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling. American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).
- Bouchareb, R., et al. Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Janssen, J. W., Helbing, A. R. Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).
- Ortlepp, J. R., et al. Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis. Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).
