mirMachine：植物miRNA注释的一站式商店
Summary
在这里，我们提出了一种新的全自动miRNA管道mirMachine，它1）可以更准确地识别已知和新型的miRNA，2）是全自动且免费提供的。用户现在可以执行一个简短的提交脚本来运行全自动的 mirMachine 管道。
Abstract
在不同类型的非编码RNA中，microRNA（miRNA）可以说在过去十年中一直备受关注。作为基因表达的转录后调节因子，miRNA在各种细胞途径中起着关键作用，包括发育和对a/生物胁迫（如干旱和疾病）的反应。拥有高质量的参考基因组序列能够在几种植物物种中鉴定和注释miRNA，其中miRNA序列高度保守。由于计算miRNA鉴定和注释过程大多是容易出错的过程，因此基于同源的预测提高了预测的准确性。在过去的十年中，我们开发并改进了miRNA注释管道SUmir，从那时起，该管道已被用于多个植物基因组。
本研究提出了一种完全自动化的新型miRNA管道mirMachine（miRNA Machine），方法是（i）在二级结构预测上增加额外的过滤步骤，（ii）使其完全自动化，以及（iii）引入新的选项来预测基于同源性的已知miRNA或使用以前的管道基于小RNA测序读数的新型miRNA。新的miRNA管道mirMachine使用拟南芥信息资源TAIR10， 拟南芥 基因组的发布和国际小麦基因组测序联盟（IWGSC）小麦参考基因组v2进行了测试。
Introduction
下一代测序技术的进步拓宽了对RNA结构和调控元件的理解，揭示了功能上重要的非编码RNA（ncRNA）。在不同类型的ncRNA中，microRNA（miRNA）构成了植物中长度在19至24个核苷酸之间的小RNA的基本调节类别1，2。自从在线虫秀丽隐杆线虫3中发现第一个miRNA以来，miRNA的存在和功能已经在动植物基因组以及4，5，6中得到了广泛的研究。miRNA通过靶向mRNA进行切割或翻译抑制来发挥作用7。越来越多的证据还表明，miRNA参与植物的各种生物过程，包括生长和发育8，自我生物发生9以及几种生物和非生物胁迫反应10。
在植物中，miRNA最初是从称为pri-miRNA11的长初级转录本加工而来的。这些由细胞核内的RNA聚合酶II产生的pri-miRNA是长转录物，形成不完美的折返结构12。pri-miRNA后来经历切割过程，产生miRNA的内源性单链（ss）发夹前体，称为pre-miRNA11。前miRNA形成发夹状结构，其中单链折叠成双链结构以切除miRNA双链（miRNA/miRNA*）13。Dicer样蛋白切割miRNA/miRNA*双链的两条链，留下2-核苷酸3′-突出部14，15。miRNA 双链体在细胞核内甲基化，保护 miRNA 的 3′-末端免受降解和尿苷化活性16，17。解旋酶在输出后解开甲基化的miRNA双链体，并将成熟的miRNA暴露于细胞质中RNA诱导的沉默复合物（RISC）18。双链的一条链是成熟的miRNA并入RISC，而另一条链miRNA*被降解。miRNA-RISC复合物与靶序列结合，导致mRNA在完全互补的情况下降解，或在部分互补的情况下导致翻译抑制13。
基于表达和生物发生特征，已经描述了miRNA注释的指南15，19。根据定义的指南，Lucas和Budak开发了SUmir管道，以在植物9中进行基于同源的计算机miRNA鉴定。SUmir 管道由两个脚本组成：SUmirFind 和 SUmirFold。SUmirFind 通过国家生物技术信息中心 （NCBI） 基本局部比对搜索工具 （BLAST） 筛选对已知的 miRNA 数据集进行相似性搜索，并使用修改后的参数来包括只有 2 个或更少不匹配的命中，并避免偏向较短的命中（blastn-short -unapped -punishment -1 -reward 1）。SUmirFold使用UNAfold 21评估BLAST20结果中推定miRNA序列的二级结构。SUmirFold通过鉴定发夹结构的特征来区分miRNA与小干扰RNA。此外，它通过参数、最小折叠能量指数> 0.67 和 GC 含量 24-71% 来区分 miRNA 与其他 ssRNA（如 tRNA 和 rRNA）。该管道最近进行了更新，增加了两个额外的步骤，以（i）提高灵敏度，（ii）提高注释准确性，以及（iii）提供预测miRNA基因的基因组分布22。鉴于植物miRNA序列23的高度保守性，该管道最初设计用于基于同源的miRNA预测。然而，这种生物信息学分析无法准确鉴定新型miRNA，因为它严重依赖于密切相关物种之间miRNA的序列保守。
本文提出了一种新的全自动miRNA管道mirMachine，它1）可以更准确地识别已知和新型miRNA（例如，该管道现在使用基于sRNA-seq的新型miRNA预测以及基于同源的miRNA鉴定）和2）完全自动化且免费提供。输出还包括预测miRNA的基因组分布。mirMachine在小麦和 拟南芥 基因组中测试了基于同源性和基于sRNA-seq的预测。虽然最初作为自由软件发布，但UNAfold在过去十年中成为商业软件。通过这次升级，二级结构预测工具从UNAfold切换到RNAfold，以便可以免费使用mirMachine。用户现在可以执行一个简短的提交脚本来运行全自动的 mirMachine 管道（ 示例在 https://github.com/hbusra/mirMachine.git 中提供）。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们的miRNA管线SUmir在过去十年中一直用于鉴定许多植物miRNA。在这里，我们开发了一种新的、全自动的、免费提供的miRNA鉴定和注释管道mirMachine。此外，许多miRNA鉴定管道，包括但不限于以前的管道，都依赖于UNAfold软件21，该软件随着时间的推移成为商业软件，尽管曾经免费提供。这种新的全自动 mirMachine 不再依赖于 UNAfold;相反，来自ViennaRNA包27 的免费RNAfold用?…
Materials
| https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK279671/ | Blast+ | ||
| https://github.com/hbusra/mirMachine.git | mirMachine submission script | ||
| https://www.perl.org/get.html | Perl | ||
| https://www.tbi.univie.ac.at/RNA/ | RNAfold | ||
| Arabidopsis TAIR10 | |||
| Triticum aestivum (wheat, IWGSC RefSeq v2) |
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