Nanopartikkelsporingsanalyse for kvantifisering og størrelsesbestemmelse av ekstracellulære vesicles

Summary

Vi demonstrerer hvordan man bruker et nytt nanopartikkelsporingsanalyseinstrument for å estimere størrelsesfordelingen og den totale partikkelkonsentrasjonen av ekstracellulære vesikler isolert fra musperigonadal fettvev og humant plasma.

Abstract

De fysiologiske og patofysiologiske rollene til ekstracellulære vesikler (ELBILER) har blitt stadig mer anerkjent, noe som gjør EV-feltet til et raskt utviklende forskningsområde. Det er mange forskjellige metoder for EV-isolasjon, hver med klare fordeler og ulemper som påvirker nedstrømsutbyttet og renheten til elbiler. Å karakterisere EV-prep isolert fra en gitt kilde ved en valgt metode er derfor viktig for tolkning av nedstrømsresultater og sammenligning av resultater på tvers av laboratorier. Det finnes ulike metoder for å bestemme størrelsen og mengden elbiler, som kan endres av sykdomstilstander eller som svar på ytre forhold. Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) er en av de fremtredende teknologiene som brukes til høygjennomstrømningsanalyse av individuelle elbiler. Her presenterer vi en detaljert protokoll for kvantifisering og størrelsesbestemmelse av elbiler isolert fra musperigonadal fettvev og humant plasma ved hjelp av en banebrytende teknologi for NTA som representerer store fremskritt innen feltet. Resultatene viser at denne metoden kan levere reproduserbare og gyldige totale partikkelkonsentrasjons- og størrelsesfordelingsdata for elbiler isolert fra forskjellige kilder ved hjelp av forskjellige metoder, som bekreftet ved transmisjonselektronmikroskopi. Tilpasningen av dette instrumentet for NTA vil adressere behovet for standardisering i NTA-metoder for å øke strenghet og reproduserbarhet i EV-forskning.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (ELBILER) er små (0,03-2 μm) membranbundne vesikler utskilt av nesten alle celletyper¹. De blir ofte referert til som “eksosomer”, “mikrovesicles” eller “apoptotiske kropper” avhengig av deres frigjøringsmekanisme og størrelse². Mens det først ble antatt at elbiler bare var et middel til å eliminere avfall fra cellen for å opprettholde homeostase³, vet vi nå at de også kan delta i intercellulær kommunikasjon via overføring av molekylært materiale – inkludert DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipider og proteiner^4,5 – og at de er viktige regulatorer for normal fysiologi samt patologiske prosesser^{1, 5,6,7,8}.

Det finnes mange forskjellige metoder for å isolere og kvantifisere elbiler, som er beskrevet andre steder^9,10,11,12. Isolasjonsprotokollen som brukes, så vel som kilden til elbiler, kan i stor grad påvirke EV-utbytte og renhet. Selv differensial sentrifugering, lenge ansett som “gullstandard” tilnærming for eksosomisolasjon, kan bli gjenstand for betydelig variasjon som senere påvirker EV-befolkningen oppnådd og nedstrøms analyser¹³. Dermed gjør de ulike metodene for EV-isolasjon og kvantifisering det vanskelig å sammenligne, reprodusere og tolke resultater av eksperimenter rapportert i litteraturen¹⁴. Videre kan EV-utgivelse reguleres av cellulære forhold eller ulike eksterne faktorer. Det har blitt antydet at elbiler spiller en rolle i å opprettholde cellulær homeostase ved å beskytte celler mot intracellulær stress¹⁵, som flere studier har vist at cellulær stress stimulerer EV-sekresjon. For eksempel har økt EV-frigjøring blitt rapportert etter cellulær eksponering for hypoksi, endoplasmisk retikulumspenning, oksidativt stress, mekanisk stress, sigarettrøykekstrakt og partikkelmateriale^{luftforurensning 16,17,18,19,20,21,22}. EV-utgivelsen har også vist seg å være modifisert in vivo; mus utsatt for et høyt fett diett eller faste i seksten timer utgitt mer adipocyte ELBILER²³. For å undersøke om en bestemt behandling eller tilstand endrer EV-utslipp, må antall elbiler bestemmes nøyaktig. Vurdering av EV-størrelsesfordelingen kan også indikere den dominerende subcellulære opprinnelsen til elbiler (f.eks. sammensmelting av sen endosomer/multivesikulære legemer med plasmamembran vs. spirende plasmamembran)²⁴. Dermed er det behov for robuste metoder for å nøyaktig måle den totale konsentrasjonen og størrelsesfordelingen til EV-prep som studeres.

En rask og svært følsom metode for visualisering og karakterisering av elbiler i løsning er nanopartikkelsporingsanalyse (NTA). En detaljert forklaring av prinsippene for denne metoden og sammenligning med alternative metoder for vurdering av EV-størrelse og konsentrasjon er beskrevet tidligere^25,26,27,28. Kort sagt, under NTA-måling visualiseres elbiler av lyset spredt når de bestråles med en laserstråle. Det spredte lyset er fokusert av et mikroskop på et kamera som registrerer partikkelbevegelsen. NTA-programvaren sporer den tilfeldige termiske bevegelsen til hver partikkel, kjent som Brownian bevegelse, for å bestemme diffusjonskoeffisienten som brukes til å beregne størrelsen på hver partikkel ved hjelp av Stokes-Einstein-ligningen. NTA ble først brukt på måling av elbiler i et biologisk utvalg i 2011²⁵. Inntil nylig var det bare to mainstream-selskaper som tilbyr kommersielle NTA-instrumenter²⁹ frem til innføringen av ViewSizer 3000 (heretter referert til som partikkelsporingsinstrumentet) som bruker en kombinasjon av nye maskinvare- og programvareløsninger for å overvinne betydelige begrensninger i andre NTA-teknikker.

Partikkelsporingsinstrumentet karakteriserer nanopartikler i væskeprøver ved å analysere deres brownske bevegelse og karakteriserer større mikronstore partikler ved å analysere gravitasjonsoppgjør. Dette instrumentets unike optiske system, som inkluderer multispektral belysning med tre laserlyskilder (ved 450 nm, 520 nm og 635 nm), gjør det mulig for forskere å analysere et bredt spekter av partikkelstørrelser (f.eksoser, mikrovesicles) samtidig. Et skjema av instrumentoppsettet vises i figur 1.

Her demonstrerer vi hvordan man utfører partikkelstørrelsesfordeling og konsentrasjonsmålinger av isolert mus og menneskelige elbiler ved hjelp av et nytt NTA-instrument.

Figur 1: Optisk system for partikkelsporingsinstrument. NTA-instrumentet lyser opp partikler med tre lasere med følgende bølgelengder: 450 nm, 520 nm, 635 nm. Videoopptak av det spredte lyset fra individuelle partikler oppdages og spores av et digitalt videokamera orientert 90° fra cuvette. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Alt arbeid med disse prøvene ble utført i samsvar med institusjonell dyrepleie- og brukskomité og institusjonelle gjennomgangsstyreretningslinjer. En skjematisk oversikt over NTA-metoden er vist i figur 2. Figur 2: Oversikt over NTA-metoden ved hjelp av partikkelsporingsinstrumentet. Prøven fremsti…

Representative Results

Før denne demonstrasjonen ble kalibreringen av instrumentet først testet for å sikre gyldigheten av de oppkjøpte dataene ved å måle størrelsesfordelingen av polystyrenperlestandarder. Vi testet størrelsesfordelingen på 100 nm og 400 nm perler ved hjelp av standard opptaksparametere og behandlingsinnstillingene som anbefales i denne protokollen (Figur 8). For 100 nm polystyrenperlestandard ble det målt en konsentrasjon på 4,205 x 107 partikler…

Discussion

Her demonstrerer vi en protokoll for NTA av elbiler for å måle størrelsesfordelingen av et bredt spekter av partikkelstørrelser samtidig og måle total EV-konsentrasjon i en polydisperseprøve. I denne studien ble musperigonadal fettvev og humant plasma brukt som kilde til elbiler. Imidlertid kan elbiler isolert fra andre vev eller biologiske væsker som serum, urin, spytt, morsmelk, fostervann og cellekultur supernatant også brukes til NTA. Målinger av polystyrenperlestandarder sørget for at instrumentet ble rikt…

Materials

1X dPBS	VWR	02-0119-1000	To dilute samples
100 nm bead standard	Thermo Scientific	3100A	To test ViewSizer 3000 calibration
400 nm bead standard	Thermo Scientific	3400A	To test ViewSizer 3000 calibration
Centrifugal Filter Unit	Amicon	UFC901024	To filter PBS diluent
Collection tubes, 2 mL	Qiagen	19201	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Compressed air duster	DustOff	DPSJB-12	To clean cuvettes
Cuvette insert	HORIBA Scientific	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Cuvette jig	HORIBA Scientific	–	To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000
De-ionized water	VWR	02-0201-1000	To clean cuvettes
Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables	Dell	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Ethanol (70-100%)	Millipore Sigma	–	To clean cuvettes
ExoQuick ULTRA	System Biosciences	EQULTRA-20A-1	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Glass scintillation vials with lids	Thermo Scientific	B780020	To clean cuvettes
"Hook" tool	Excelta	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Lint-free microfiber cloth	Texwipe	TX629	To clean cuvettes and cover work surface
Microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	22363344	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Stir bar	Sp Scienceware	F37119-0005
Suprasil Quartz cuvette with cap	Agilent Technologies	AG1000-0544	Initially provided with purchase of ViewSizer 3000
ViewSizer 3000	HORIBA Scientific	–	Nanoparticle tracking instrument