Fremstilling af humant væv indlejret i optimal skæretemperaturforbindelse til massespektrometrianalyse
Summary
Sphingolipider er bioaktive metabolitter med veletablerede roller i menneskelig sygdom. Karakterisering af ændringer i væv med massespektrometri kan afsløre roller i sygdomsætiologi eller identificere terapeutiske mål. OCT-forbindelsen, der anvendes til kryopræservering i biorepositorier, interfererer imidlertid med massespektrometri. Vi skitserer metoder til at analysere sphingolipider i humant væv indlejret i OCT med LC-ESI-MS / MS.
Abstract
Sphingolipider er cellulære komponenter, der har veletablerede roller i menneskelig metabolisme og sygdom. Massespektrometri kan bruges til at bestemme, om sphingolipider ændres i en sygdom og undersøge, om sphingolipider kan målrettes klinisk. Imidlertid kan korrekt drevne prospektive undersøgelser, der erhverver væv direkte fra den kirurgiske suite, være tidskrævende og teknisk, logistisk og administrativt udfordrende. I modsætning hertil kan retrospektive undersøgelser drage fordel af kryopræserverede humane prøver, der allerede er tilgængelige, normalt i stort antal, ved vævsbiorepositorier. Andre fordele ved at skaffe væv fra biorepositorier omfatter adgang til information forbundet med vævsprøverne, herunder histologi, patologi og i nogle tilfælde klinikopatologiske variabler, som alle kan bruges til at undersøge korrelationer med lipidomics-data. Imidlertid er tekniske begrænsninger relateret til inkompatibiliteten af optimal skæretemperaturforbindelse (OCT), der anvendes i kryopræservering og massespektrometri, en teknisk barriere til analyse af lipider. Vi har dog tidligere vist, at OCT let kan fjernes fra humane biorepositoriprøver gennem cyklusser med vask og centrifugering uden at ændre deres sphingolipidindhold. Vi har også tidligere fastslået, at sphingolipider i humant væv kryopræserveret i OCT er stabile i op til 16 år. I denne rapport skitserer vi trinene og arbejdsgangen til analyse af sphingolipider i humane vævsprøver, der er indlejret i OCT, herunder vaskevæv, vejning af væv til datanormalisering, ekstraktion af lipider, forberedelse af prøver til analyse ved væskekromatografi elektrosprayionisering tandem massespektrometri (LC-ESI-MS / MS), massespektrometridataintegration, datanormalisering og dataanalyse.
Introduction
Sphingolipider er bioaktive metabolitter kendt for deres roller i human metabolisme og sygdom 1,2. De regulerer komplekse cellulære processer såsom cellemigration, celleoverlevelse og død, cellebevægelse, vesikulær handel, cellulær invasion og metastase, angiogenese og produktion af cytokiner 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defekter i reguleringen af sphingolipidmetabolisme bidrager til initiering og progression af kræftformer, bestemmer, hvor aggressive kræftformer er, og hvordan kræft reagerer på og udvikler resistens over for terapi 3,10. På grund af disse brede indvirkninger på sygdommens ætiologi er analysemetoder, der præcist kan etablere sygdomsspecifikke sphingolipidændringer, derfor vigtige værktøjer. Massespektrometri (MS) er den mest nøjagtige og pålidelige metode til at analysere sphingolipidændringer.
Humane prøver, der kan bruges til analyse af sphingolipidændringer, kan opnås prospektivt fra den kirurgiske suite eller retrospektivt fra vævsbiorepositorier. Friske væv fra kirurgi er fordelagtige, fordi de kan analyseres direkte ved MS eller andre analysemetoder. Imidlertid har erhvervelse af væv fremadrettet administrative, tekniske og logistiske forhindringer, og det kan være udfordrende at indsamle tilstrækkelige prøver til at nå statistisk magt. At få væv fra biorepositorier er fordelagtigt, fordi de kan erhverves retrospektivt i stort antal, og biorepositorier bekræfter histologi og patologi, bruger standardprocedurer til kryogent at bevare og opbevare væv og kan levere klinikopatologiske data, der kan bruges til korrelationsanalyser. For at bevare molekylære og strukturelle træk kan biorepositorier imidlertid kryopræservere væv ved at indlejre dem i optimal skæretemperatur (OCT) forbindelse, som vi har vist interfererer med datanormaliseringsassays og kvantificering af sphingolipider ved væskekromatografi elektrosprayionisering tandem massespektrometri (LC-ESI-MS / MS)11 . Det har også vist sig, at polyvinylalkohol og polyethylenglycol, de primære komponenter i OCT-forbindelse, resulterer i ionundertrykkelse i andre MS-analyseplatforme12,13,14,15. Derfor skal OCT-forbindelsen fjernes fra væv inden sphingolipidomisk analyse af MS.
I en tidligere rapport har vi valideret en protokol til fjernelse af OCT-forbindelse fra humane prøver til LC-ESI-MS / MS-analyse 11 og den metode, der anvendes til vejning af væv til datanormalisering11. Her beskriver vi trinene i den sphingolipidomiske OCT-forbindelsesfjernelsesprotokol (sOCTrP) og viser repræsentative data fra humane lungeadenocarcinomtumorer og normale tilstødende ikke-involverede væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT er et almindeligt langsigtet kryokonserveringsmiddel, der anvendes i biorepositorier. OCT kan dog resultere i ionundertrykkelse, når væv analyseres af forskellige massespektrometriplatforme12,13,14,15, eller resultere i tab af signal, når prøver analyseres af LC-ESI-MS / MS 11. OCT i kryopræserveret væv kan også forstyrre vævsnormaliseringsmetoder såsom vejn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tjenester og støtte til forskningsprojektet blev leveret af VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core og VCU Lipidomics and Metabolomics Core, som delvist støttes med finansiering fra NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago Lima).
Materials
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13×100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13×100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 53822-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13×100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
Referências
- Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
- Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Hla, T., Dannenberg, A. J. Sphingolipid signaling in metabolic disorders. Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).
- Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
- Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
- Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
- Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
- Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
- Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. . Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).
- Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
- Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
- Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
- Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
- Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).
