הכנת רקמות אנושיות משובצות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית לניתוח ספקטרומטריית מסה
Summary
ספינגוליפידים הם מטבוליטים ביו-אקטיביים בעלי תפקידים מבוססים היטב במחלות אנושיות. אפיון שינויים ברקמות עם ספקטרומטריית מסה יכול לחשוף תפקידים באטיולוגיה של מחלות או לזהות מטרות טיפוליות. עם זאת, תרכובת ה-OCT המשמשת לשימור בהקפאה בביו-רפוזיטורים מפריעה לספקטרומטריית מסה. אנו מתארים שיטות לניתוח ספינגוליפידים ברקמות אנושיות המוטמעות ב-OCT עם LC-ESI-MS/MS.
Abstract
ספינגוליפידים הם מרכיבים תאיים שיש להם תפקידים מבוססים היטב בחילוף החומרים ובמחלות אנושיות. ניתן להשתמש בספקטרומטריית מסות כדי לקבוע אם ספינגוליפידים משתנים במחלה ולחקור אם ספינגוליפידים יכולים להיות ממוקדים קלינית. עם זאת, מחקרים פרוספקטיביים המופעלים כראוי הרוכשים רקמות ישירות מחדר הניתוח עשויים לגזול זמן רב, ומאתגרים מבחינה טכנית, לוגיסטית ומנהלית. לעומת זאת, מחקרים רטרוספקטיביים יכולים לנצל דגימות אנושיות בהקפאה שכבר זמינות, בדרך כלל במספרים גדולים, בביו-רפוזיטוריות של רקמות. יתרונות נוספים של רכישת רקמות מביו-רפוזיטוריות כוללים גישה למידע הקשור לדגימות הרקמות, כולל היסטולוגיה, פתולוגיה, ובמקרים מסוימים משתנים קליניים-פתולוגיים, שכולם יכולים לשמש לבחינת קורלציות עם נתוני ליפידומיקה. עם זאת, מגבלות טכניות הקשורות לחוסר תאימות של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) המשמשת בהקפאה ובספקטרומטריית מסה היא מחסום טכני לניתוח שומנים. עם זאת, הראינו בעבר כי OCT ניתן להסיר בקלות מדגימות biorepository אנושי באמצעות מחזורים של שטיפות וצנטריפוגות מבלי לשנות את התוכן sphingolipid שלהם. כמו כן, קבענו בעבר כי ספינגוליפידים ברקמות אנושיות המוקפאים ב-OCT יציבים עד 16 שנים. בדו”ח זה, אנו מתארים את השלבים ואת זרימת העבודה לניתוח sphingolipids בדגימות רקמות אנושיות המוטמעות ב- OCT, כולל רקמות שטיפה, שקילת רקמות לנורמליזציה של נתונים, מיצוי שומנים, הכנת דגימות לניתוח על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אלקטרוספריי יינון טנדם ספקטרומטריית מסה (LC-ESI-MS/MS), אינטגרציה של נתוני ספקטרומטריית מסה, נורמליזציה של נתונים וניתוח נתונים.
Introduction
ספינגוליפידים הם מטבוליטים ביו-אקטיביים הידועים בתפקידם בחילוף החומרים האנושי ובמחלות 1,2. הם מווסתים תהליכים תאיים מורכבים כגון נדידת תאים, הישרדות תאים ומוות, תנועת תאים, סחר בשלפוחית, פלישה תאית וגרורות, אנגיוגנזה וייצור ציטוקינים 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . פגמים בוויסות חילוף החומרים של ספינגוליפידים תורמים לייזום והתקדמות של סרטן, קובעים עד כמה סוגי סרטן אגרסיביים, וכיצד סוגי סרטן מגיבים ומפתחים עמידות לטיפול 3,10. לכן, בגלל ההשפעות הרחבות הללו על האטיולוגיה של המחלה, שיטות אנליטיות שיכולות לקבוע במדויק שינויים sphingolipid ספציפיים למחלה הם כלים חשובים. ספקטרומטריית מסות (MS) היא השיטה המדויקת והאמינה ביותר לניתוח שינויים ספינגוליפידים.
דגימות אנושיות שניתן להשתמש בהן לניתוח של שינויים sphingolipid ניתן להשיג באופן פרוספקטיבי מן הסוויטה כירורגית או בדיעבד מן biorepositories רקמות. רקמות טריות מניתוח הן יתרון מכיוון שניתן לנתח אותן ישירות על ידי טרשת נפוצה או שיטות אנליטיות אחרות. עם זאת, רכישת רקמות באופן פרוספקטיבי כוללת מכשולים אדמיניסטרטיביים, טכניים ולוגיסטיים, ואיסוף דגימות מספיקות כדי להגיע לעוצמה סטטיסטית יכול להיות מאתגר. קבלת רקמות מביו-רפוזיטורים היא יתרון מכיוון שניתן לרכוש אותן בדיעבד, במספרים גדולים, וביו-רפוזיטורים מאשרים היסטולוגיה ופתולוגיה, משתמשים בהליכי הפעלה סטנדרטיים כדי לשמר ולאחסן רקמות באופן קריוגני, ויכולים לספק נתונים קליניים-פתולוגיים שיכולים לשמש לניתוחי קורלציה. עם זאת, כדי לשמר תכונות מולקולריות ומבניות, ביו-רפוזיטורים עשויים להקפיא רקמות על ידי הטמעתן בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), אשר הראינו מפריעה למבחני נורמליזציה של נתונים ולכימות של ספינגוליפידים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אלקטרוספריי יינון טנדם ספקטרומטריית מסה (LC-ESI-MS/MS)11 . כמו כן, הוכח כי אלכוהול פוליוויניל ופוליאתילן גליקול, המרכיבים העיקריים בתרכובת OCT, גורמים לדיכוי יונים בפלטפורמות ניתוח אחרות של טרשת נפוצה12,13,14,15. לכן, יש להסיר תרכובת OCT מהרקמות לפני ניתוח ספינגוליפידומי על ידי טרשת נפוצה.
בדו”ח קודם, אימתנו פרוטוקול להסרת תרכובת OCT מדגימות אנושיות לניתוח LC-ESI-MS/MS 11 ואת המתודולוגיה המשמשת לשקילת רקמות לנורמליזציה של נתונים11. כאן, אנו מפרטים את השלבים של פרוטוקול הסרת תרכובת OCT sphingolipidomic (sOCTrP) ומראים נתונים מייצגים מגידולי אדנוקרצינומה של ריאה אנושית ורקמות לא מעורבות סמוכות רגילות.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT הוא חומר שימור קריו נפוץ לטווח ארוך המשמש בביו-ריפוזיטורים. עם זאת, OCT יכול לגרום לדיכוי יונים כאשר רקמות מנותחות על ידי פלטפורמות ספקטרומטריית מסהשונות 12,13,14,15, או לגרום לאובדן אות כאשר דגימות מנותחות על ידי LC-ESI-MS/…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
השירותים והתמיכה של פרויקט המחקר סופקו על ידי מרכז הסרטן VCU מאסי רקמות ואיסוף וניתוח נתונים הליבה והליבה של VCU Lipidomics and Metabolomics, הנתמכים בחלקם במימון מענק התמיכה של מרכז הסרטן NIH-NCI P30CA016059. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות R21CA232234 (סנטיאגו לימה).
Materials
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13×100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13×100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 53822-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13×100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
Referências
- Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
- Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Hla, T., Dannenberg, A. J. Sphingolipid signaling in metabolic disorders. Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).
- Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
- Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
- Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
- Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
- Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
- Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. . Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).
- Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
- Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
- Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
- Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
- Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).
