Bewertung der globalen DNA-Doppelstrang-Endsektion mittels BrdU-DNA-Markierung in Verbindung mit Cell Cycle Discrimination Imaging
Summary
Im vorliegenden Protokoll demonstrieren wir, wie die DNA-Doppelstrang-Endsektion während der S/G2-Phase des Zellzyklus mit einer immunfluoreszenzbasierten Methode visualisiert werden kann.
Abstract
Die Untersuchung der DNA-Schadensantwort (DDR) ist ein komplexes und essentielles Feld, das durch den Einsatz von DDR-targeting-Medikamenten zur Krebsbehandlung nur noch wichtiger geworden ist. Diese Ziele sind Poly(ADP-Ribose)-Polymerasen (PARPs), die verschiedene Formen der DNA-Reparatur initiieren. Die Hemmung dieser Enzyme mit PARP-Inhibitoren (PARPi) erreicht eine synthetische Letalität, indem eine therapeutische Verwundbarkeit in homologen Rekombinations- (HR)-defizienten Zellen aufgrund von Mutationen bei Brustkrebs Typ 1 (BRCA1), BRCA2 oder Partner und Lokalisierer von BRCA2 (PALB2) verliehen wird.
Zellen, die mit PARPi behandelt werden, akkumulieren DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs). Diese Brüche werden von der DNA-Endresektionsmaschinerie verarbeitet, was zur Bildung von einzelsträngiger (ss) DNA und anschließender DNA-Reparatur führt. In einem BRCA1-defizienten Kontext verursacht die Wiederbelebung der DNA-Resektion durch Mutationen in DNA-Resektionsinhibitoren wie 53BP1 und DYNLL1 eine PARPi-Resistenz. Daher ist die Möglichkeit, die DNA-Resektion in Cellulo zu überwachen, entscheidend für ein klareres Verständnis der DNA-Reparaturwege und die Entwicklung neuer Strategien zur Überwindung der PARPi-Resistenz. Immunfluoreszenz (IF)-basierte Techniken ermöglichen die Überwachung der globalen DNA-Resektion nach DNA-Schäden. Diese Strategie erfordert eine langpulsige genomische DNA-Markierung mit 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU). Nach DNA-Schäden und DNA-Endresektion wird die resultierende einzelsträngige DNA von einem Anti-BrdU-Antikörper unter nativen Bedingungen spezifisch nachgewiesen. Darüber hinaus kann die DNA-Resektion auch mit Hilfe von Zellzyklusmarkern untersucht werden, um zwischen verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu unterscheiden. Zellen in der S /G2-Phase ermöglichen die Untersuchung der Endresektion innerhalb der HR, während G1-Zellen zur Untersuchung des nicht-homologen Endzusammenfügens (NHEJ) verwendet werden können. Ein detailliertes Protokoll für diese IF-Methode, gekoppelt an die Zellzyklusunterscheidung, wird in diesem Artikel beschrieben.
Introduction
Die Modulation von DNA-Reparaturfaktoren ist eine sich ständig weiterentwickelnde Methode für die Krebstherapie, insbesondere in DNA-DSB-Reparatur-defizienten Tumorumgebungen. Die Hemmung spezifischer Reparaturfaktoren ist eine der genialen Strategien, um Krebszellen für DNA-schädigende Wirkstoffe zu sensibilisieren. Jahrzehntelange Forschung führte zur Identifizierung verschiedener Mutationen von DNA-Reparaturgenen als Biomarker für therapeutische Strategieentscheidungen1. Infolgedessen ist das DNA-Reparaturfeld zu einem Zentrum für die Arzneimittelentwicklung geworden, um eine breite Palette von Behandlungen zu gewährleisten und das Konzept der personalisierten Medizin zu stärken.
DSBs werden durch zwei Hauptwege repariert: NHEJ und HR2. Der NHEJ-Signalweg ist fehleranfällig, indem er die beiden DNA-Enden mit wenig bis gar keiner DNA-Endverarbeitung schnell ligariert und die Proteinkinase (DNA-PKcs), den Ku70/80-Komplex, 53BP1 und RIF1-Proteine3 umfasst. Im Gegensatz dazu ist HR ein treuer Mechanismus, der von BRCA14 initiiert wurde. Ein wesentlicher Schritt bei der HR-Reparatur ist der DNA-Endresektionsprozess, bei dem es sich um den Abbau der gebrochenen Enden handelt, der zu einzelsträngiger (ss) DNA mit 3′-OH-Enden führt. BRCA1 erleichtert die Rekrutierung der nachgeschalteten Proteine, die das Resektosom MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1 bilden, die an der 5′ bis 3′ DNA-Resektion beteiligt sind5.
Die anfängliche Endresektion wird durch die Endonukleaseaktivität von MRE11 erreicht, was eine weitere Verarbeitung durch die DNA2- und EXO1-Nukleasen ermöglicht. Die erzeugten ssDNA-Überhänge werden schnell mit Replikationsprotein A (RPA) beschichtet, um sie vor einer weiteren Verarbeitung zu schützen. Anschließend setzen BRCA2, PALB2 und BRCA1 ein, um die Verschiebung von RPA und die Montage des RAD51-Nukleofilaments zu vermitteln, das für den homologiegesteuerten Reparaturmechanismus erforderlich ist. Eine feine Balance zwischen der Verwendung von NHEJ und HR ist für die optimale Aufrechterhaltung der genomischen Integrität notwendig. Die Wahl des Weges hängt von der Zellzyklusphase ab. HR wird bevorzugt während der S- bis G2-Phasen verwendet, in denen die DNA-Resektion auf höchstem Niveau ist und die Schwesterchromatiden zur Verfügung stehen, um eine ordnungsgemäße Reparatur zu gewährleisten.
Poly (ADP-ribose) Polymerase 1 (PARP-1) ist eines der frühesten Proteine, die für das DSB rekrutiert wurden. Es regelt sowohl die Resektionsaktivität als auch die Montage von nachgeschalteten Effektoren, die am NHEJ5,6 beteiligt sind. PARP-1 wird auch für die Reparatur von DNA-Einzelsträngelbrüchen während der Replikation benötigt7,8. Aufgrund seiner wichtigen Rolle bei der DNA-Reparatur werden PARP-Inhibitoren (PARPi) als Krebstherapien eingesetzt. Bei mehreren HR-defizienten Krebsarten führt die PARPi-Behandlung zu einer synthetischen tödlichen Reaktion aufgrund der Unfähigkeit von HR-defizienten Zellen, den akkumulierten Schaden über einen alternativen Weg zu reparieren9,10. Derzeit gibt es vier von der FDA zugelassene PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib und Talazoparib (auch BMN 673 genannt), die für verschiedene Brust- und Eierstockkrebsbehandlungen eingesetzt werden11. PARPi-Resistenzen sind jedoch häufig, und eine mögliche Ursache entsteht durch den Erneuterwerb von HR-Kenntnissen12. Der Verlust oder die Hemmung von PARP-1 in Gegenwart von Bestrahlung dysreguliert die Resektosom-Maschinerie, was zur Anhäufung längerer ssDNA-Trakte führt13. Daher ist eine eingehende Untersuchung der DNA-Resektion in vivo entscheidend für ein klareres Verständnis der DNA-Reparaturwege und die anschließende Entwicklung neuer Strategien zur Behandlung von Krebs und zur Überwindung der PARPi-Resistenz.
Es wurden mehrere Methoden verwendet, um DNA-Resektionsereignisse nachzuweisen5. Eine solche Methode ist die klassische IF-basierte Technik, die eine indirekte Färbung und Visualisierung der resezierten DNA nach stressinduziertem DSB unter Verwendung eines Anti-RPA-Antikörpers ermöglicht. Die Markierung genomischer DNA mit 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU) und der Nachweis von nur ssDNA ist eine direkte Messung von DNA-Resektionsereignissen. Es umgeht die Überwachung von RPA, die an mehreren zellulären Prozessen wie der DNA-Replikation beteiligt ist. Bei der hier beschriebenen Methode ermöglichen zellen, die mit BrdU für einen einzelnen Zellzyklus inkubiert wurden, dass BrdU in einen Strang der replizierenden zellulären DNA eingebaut wird. Nach der Resektion wird die IF-Färbung unter Bedingungen durchgeführt, die einen BrdU-Nachweis nur in der ssDNA-Form unter Verwendung eines Anti-BrdU-Antikörpers ermöglichen. Dieser Antikörper kann nur auf exponierte BrdU-Nukleotide zugreifen und erkennt keine in doppelsträngige DNA integrierten Nukleotide. Mittels Fluoreszenzmikroskopie kann die resezierte DNA in Form von punktförmigen BrdU/ssDNA-Herden sichtbar gemacht werden. Die Kernintensität dieser Herde kann als Auslesung verwendet werden, um die Resektion nach DNA-Schäden zu quantifizieren. Diese Arbeit beschreibt Schritt für Schritt die Prozesse dieser Methode, die auf die meisten Säugetierzelllinien angewendet werden kann. Diese Methode sollte als einfache Möglichkeit zur Überwachung der DNA-Endresektion in Cellulo als Proof of Concept von großem Nutzen sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel beschreibt eine Methode, die die IF-Färbung nutzt, um Variationen in der DNA-Resektion in Cellulo zu messen. Der aktuelle Standard für die Beobachtung eines Effekts auf die DNA-Resektion ist die RPA-Färbung; Dies ist jedoch eine indirekte Methode, die durch DNA-Replikation beeinflusst werden kann. Zuvor wurde eine weitere BrdU-Inkorporations-basierte DNA-Resektions-IF-Technik zur Klassifizierung der resultierenden Intensitäten in BrdU-positiven und BrdU-negativen Zellen beschrieben. Diese Meth…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Marie-Christine Caron für die hervorragende technische Beratung. Diese Arbeit wird durch Mittel der Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879) unterstützt. J.-Y.M. hat einen Tier 1 Canada Research Chair in DNA Repair and Cancer Therapeutics inne. J.O’S ist ein FRQS PhD Student Fellow und S.Y.M ist ein FRQS Postdoctoral Fellow.
Materials
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
Referências
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