次世代シーケンシングを使用して、CD4プロモーター近傍のCAS9誘導二本鎖切断の修復に関連する変異を同定
Summary
ここでは、CD4プロモーター近傍の二本鎖切断修復に関連する変異を同定するために使用できるsgRNA/CAS9エンドヌクレアーゼおよび次世代シーケンシングプロトコルを紹介します。
Abstract
DNA中の二本鎖切断(DSB)は、DNA損傷の最も細胞傷害性のあるタイプである。無数の侮辱がこれらの病変(例えば、複製ストレス、電離放射線、修復されていないUV損傷)をもたらす可能性があるため、DSBは毎日ほとんどの細胞で発生します。細胞死に加えて、修復されていないDSBはゲノムの完全性を低下させ、結果として生じる変異は腫瘍形成を促進する可能性がある。これらのリスクとDSBの有病率は、細胞がこれらの病変を修復するメカニズムの調査を動機付ける。次世代シーケンシングは、電離放射線によるDSBの誘導と組み合わせることができ、DSB修復欠陥に関連する変異を正確に定義するための強力なツールを提供します。しかし、このアプローチでは、電離放射線に関連するランダムに発生するDSBの修復を検出するために、計算上困難でコストのかかる全ゲノムシーケンシングが必要です。I-Sce1などの希少切断エンドヌクレアーゼは、単一のDSBを生成する能力を提供するが、それらの認識部位は目的のゲノムに挿入されなければならない。その結果、修復部位は本質的に人工的である。最近の進歩により、ガイドRNA(sgRNA)はCas9エンドヌクレアーゼを目的の任意のゲノム遺伝子座に誘導することができます。これは、Cas9誘導DSBに隣接するDNAに焦点を合わせることを可能にすることによって、次世代シーケンシングをより費用対効果の高いものにするDSB修復の研究に適用できる可能性がある。原稿の目標は、CD4遺伝子の上流のDSBの修復に由来する変異を定義できるプロトコルを提示することによって、このアプローチの実現可能性を実証することである。このプロトコルは、比較的限られた計算要件で、修復阻害剤、ウイルスタンパク質発現、突然変異、および環境曝露などの外因性因子に関連するDSBの変異原性電位の変化を決定するために適合させることができる。生物のゲノムが配列決定されると、この方法は理論的には、任意のゲノム遺伝子座およびトランスフェクト可能なその生物の任意の細胞培養モデルにおいて採用され得る。このアプローチの同様の適応は、同じ遺伝的背景にある異なる遺伝子座間の修復忠実度の比較を可能にする可能性がある。
Introduction
ゲノムの安定性を維持することは、すべての生物にとって非常に重要です。正確なDNA複製と堅牢なDNA損傷応答(DDR)は、遺伝物質を忠実に伝播するために必要である1,2。DNA損傷は、ほとんどの細胞で定期的に起こる2,3。これらの損傷が感知されると、細胞周期の進行が止まり、DNA修復機構が活性化される。DNAまたはDSBの二本鎖切断は、DNA損傷の中で最も有毒で変異原性のあるタイプである3,4。
いくつかのDDRシグナル伝達経路がこれらの病変を修復することができるが、最も徹底的に研究されたDSB修復経路は相同組換え(HR)および非相同末端結合(NHEJ)である。HRは、姉妹染色分体を相同テンプレートとして使用してDSBを修復する、ほとんどエラーのない経路です。これは、細胞周期5、6、7のS期およびG2期において起こる傾向がある。NHEJはよりエラーが発生しやすいが、細胞周期全体を通して起こり得る8,9。特異的修復機構の効率を測定するために様々なレポーターアッセイが開発されている10、11、12。これらのアッセイは、GFPまたはmCherryを読み出しとして用いたDSB修復経路活性のハイスループット測定のためにフローサイトメトリーに依存する傾向がある11、13。非常に効率的ですが、人工的に導入されたDSBで発生する標準的な修復に依存しています。
DSB修復を研究するために使用される他の様々な方法があります。これらの多くは、免疫蛍光(IF)顕微鏡1,14に依存している。IF顕微鏡は、DSBが遺伝毒性化学物質または電離放射線への曝露によって誘導された後の修復複合体を代表する離散核病巣を検出する15,16。これらの病巣の形成および解決を追跡することは、それぞれ修復の開始および完了の指標を提供する14、17。しかしながら、DSB誘導のこれらの方法(すなわち、化学物質または電離放射線)は、ゲノム中の定義された位置でDSBを引き起こさない。また、それらを使用して、少数のDSBのみ(例えば、2〜4個)のみを一貫して誘導することも機能的に不可能である。その結果、DSBを誘導する最も一般的に使用される方法は、ゲノム全体にランダムに分布する多数の病変を引き起こす18。希少切断エンドヌクレアーゼの認識部位を挿入し、I-Sce119などの適切なエンドヌクレアーゼを発現させることにより、少数のDSBを導入することができる。残念なことに、標的部位の必要な統合は、内因性ゲノム遺伝子座におけるDSBの検査を妨げる。
本稿では、ユーザ定義遺伝子座で発生したDSBの修復に関連する変異を検出する方法を記載する。我々は、DSBに関連する変異の数を増加させるウイルスタンパク質の能力を評価するために適用されるアプローチの代表例を提供する。具体的には、この原稿は、ヒト包皮ケラチノサイトにおけるヒトCD4オープンリーディングフレームでDSBを誘導するためにCAS9エンドヌクレアーゼを指示するための単一のガイドRNA(sgRNA)の使用を記載するベクターコントロール(HFK LXSN)およびヒトパピローマウイルス8型(HFK 8E6)のE6タンパク質を発現するHFKを発現する。ブレークを取り囲む領域の標的次世代シーケンシング(NGS)は、病変の修復に関連する変異を厳密に定義することを可能にする。これらのデータは、ウイルスタンパク質がDSB修復中に変異の約20倍の増加を引き起こすことを実証している。また、全ゲノムシーケンシングを必要とせずに、単一の遺伝子座におけるDSBの変異原性の影響を偏りなく特徴付けます。原則として、このプロトコルは、ゲノム遺伝子座または細胞株間の突然変異の相対リスクを比較するために容易に適合させることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
提供される情報の深さに加えて、この方法にはいくつかの利点があります。第1に、DSB修復は、理論的には、目的の細胞のゲノムを改変することなく任意のゲノム遺伝子座で評価することができる。第二に、修理のNGS分析へのアクセスは、定義された領域をターゲットにした単一のDSBを作成して分析することによって得られるコストと計算労力の削減によって増加します。最後に、追加の生物…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿で報告された研究は、国立衛生研究所(P20GM130448)(NAWおよびRP)の国立一般医学研究所によって支援されました。国立衛生研究所の国立がん研究所 (NCI R15 CA242057 01A1);カンザス州立大学のジョンソンがん研究センター;米国国防総省(CMDRP PRCRP CA160224(NAW))です。KSU-CVM Confocal CoreとJoel Sannemanの免疫蛍光顕微鏡検査に感謝します。コンテンツは著者の責任であり、必ずしもこれらの資金提供機関の公式見解を表すものではありません。
Materials
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
Referências
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
- Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).
- Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
- vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
- Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).
- Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
- Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
- Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
- Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
- Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).
- Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).
- Kuo, L. J., Yang, L. -. X. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
- Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).
- Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genética. 152 (3), 1037-1044 (1999).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).
- Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356 (2020).
- Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).
- Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).
