Методы микроинъекции необходимы для введения экзогенных генов в геномы комаров. Этот протокол объясняет метод, используемый лабораторией Джеймса для микроинъекции ДНК в эмбрионы Anopheles gambiae для генерации трансформированных комаров.
Методы микроинъекции эмбрионов необходимы для многих молекулярных и генетических исследований видов насекомых. Они обеспечивают средства для введения экзогенных фрагментов ДНК, кодирующих интересующие гены, а также благоприятные признаки в зародышевую линию насекомых стабильным и наследуемым образом. Полученные трансгенные штаммы могут быть изучены на предмет фенотипических изменений, возникающих в результате экспрессии интегрированной ДНК для ответа на основные вопросы или использованы в практических приложениях. Хотя технология проста, она требует от исследователя терпения и практики для достижения уровня мастерства, который максимизирует эффективность. Здесь показан метод микроинъекции эмбрионов африканского малярийного комара Anopheles gambiae. Цель состоит в том, чтобы доставить путем микроинъекции экзогенную ДНК к эмбриону, чтобы она могла быть поглощена развивающимися клетками зародышевой линии (полюса). Экспрессия из введенной ДНК транспозаз, интеграз, рекомбиназ или других нуклеаз (например, CRISPR-ассоциированных белков, Cas) может вызвать события, которые приводят к его ковалентной вставке в хромосомы. Трансгенные An. gambiae, полученные на основе этих технологий, были использованы для фундаментальных исследований компонентов иммунной системы, генов, участвующих в кроветворении, и элементов обонятельной системы. Кроме того, эти методы были использованы для получения штаммов An. gambiae с признаками, которые могут помочь контролировать передачу малярийных паразитов.
Методы микроинъекции использовались для экспериментального манипулирования организмами с начала 1900-х годов1. Микроинъекция использовалась для изучения как основных биологических функций, так и/или внесения важных изменений в биологию желаемого организма. Метод микроинъекции представляет особый интерес для векторных биологов и широко используется для манипулирования векторными геномами2-11. Эксперименты по трансгенезу на векторах членистоногих часто направлены на то, чтобы сделать векторы менее эффективными при передаче патогенов путем либо внесения изменений, которые уменьшают приспособленность вектора, либо повышения рефрактерности к патогенам, которые они передают. Комары передают различные патогены человека и оказывают значительное влияние на заболеваемость и смертность во всем мире. Род комаров Anopheles передает паразитарным возбудителям малярии человека, Plasmodium spp. Генно-инженерные эксперименты с Anopheles были направлены на лучшее понимание биологии и снижение векторной способности этих комаров в усилиях по разработке новых стратегий элиминации малярии.
Комары-переносчики, которые способствуют наибольшему количеству случаев заражения малярией во всем мире, находятся в видовом комплексе Anopheles gambiae. Тем не менее, большинство успешных экспериментов по трансгенезу были проведены на переносчике малярии индийского субконтинента Anopheles stephensi. В то время как существует множество лабораторно адаптированных штаммов Anopheles gambiae, количество трансгенных линий Anopheles gambiae spp., о которых сообщается в литературе, не сравнится с количеством линий Anopheles stephensi. Считается, что эмбрион Anopheles gambiae труднее ввести и достичь успешного трансгенеза, чем Anopheles stephensi,хотя причины этих различий неизвестны. Этот протокол описывает метод, который доказал свою неизменно успешную способность к достижению трансгенеза эмбрионов Anopheles gambiae с помощью микроинъекции. Протокол основан на методе, ранее разработанном Эрве Боссеном и Марком Бенедиктом12 с добавлением некоторых дополнительных деталей и изменений, которые, как было установлено, повышают эффективность трансгенеза.
С увеличением доступности точных и гибких технологий генной инженерии, таких как CRISPR / Cas9, трансгенные организмы могут быть разработаны более простым и стабильным способом, чем это было возможно ранее. Эти инструменты позволили исследователям создать трансгенные штаммы комаров-перено…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны Друзилле Стиллингер, Кионе Паркер, Пэрриш Пауэлл и Мадлен Ноттоли за разведение комаров. Финансирование было предоставлено Калифорнийским университетом, Ирвинской инициативой по борьбе с малярией. AAJ является профессором Дональда Брена в Калифорнийском университете в Ирвине.
10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
Forceps | No. 5 size | ||
Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
KCl | 50 mM | ||
Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
Micropipette | Rainin | 20 µL | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
Nylon mesh | |||
Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
Sodium acetate | 3M | ||
Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |