חתך אופטי והדמיה של הדיסק הבין חולייתי מהתפתחות עוברית לניוון
Summary
אנו מציגים שיטה לחקור ארגון כונדרוציטים מרחבי בסיברווס אנולוס של הדיסק הבין חולייתי בשיטת חתך אופטית.
Abstract
ניוון דיסק בין חולייתי (IVD) הוא גורם מוביל לכאבי גב תחתון והוא כרוך במידה גבוהה של פגיעה עבור אנשים מושפעים. כדי לפענח ניוון דיסק ולהיות מסוגל לפתח גישות התחדשות הבנה יסודית של הביולוגיה התאית של IVD הוא חיוני. היבט אחד של ביולוגיה זו שעדיין נותר ללא מענה הוא השאלה כיצד תאים מסודרים מרחבית במצב פיזיולוגי ובמהלך ניוון. המאפיינים הביולוגיים של IVD וזמינותו מקשים על ניתוח רקמה זו. המחקר הנוכחי חוקר ארגון כונדרוציטים מרחבי בסיברווס אנולוס מהתפתחות עוברית מוקדמת ועד ניוון סופני. שיטת חתך אופטית (Apotome) מוחלת כדי לבצע ניתוחי כתמים ברזולוציה גבוהה באמצעות רקמת עובר בקר כמודל בעלי חיים ורקמת דיסק אנושית המתקבלת מחולים שעברו ניתוח בעמוד השדרה. מתוך צפיפות כונדרוציטים גבוהה מאוד בדיסק בקר עוברי מוקדם, מספר התאים פוחת במהלך ההריון, הצמיחה וההתבגרות. בדיסקים אנושיים, עלייה בצפיפות התאים ליוותה את התקדמות ניוון הרקמות. כפי שכבר הוכח בסחוס מפרקי, היווצרות אשכול מייצג תכונה אופיינית של ניוון דיסק מתקדם.
Introduction
הדיסק הבין חולייתי (IVD) הוא מבנה מבוסס סחוס, כי ביוכימית וביחס לארכיטקטורה הסלולר, ממבט ראשון, דומה במובנים רבים הסחוס המפרקי1. ואכן, הן ניוון IVD והן דלקת מפרקים ניוונית (OA) של סחוס מפרקים מאופיינים על ידי צמצום שטח משותף עקב שחיקת סחוס, ציסטה תת-כונדרית היווצרות אוסטאופיפט, וטרשת תת-ביתית2,3. למרות הדמיון לכאורה הזה ארכיטקטורה ותפקיד תפקודי של שתי הרקמות שונים. בעוד המטריצה של סחוס מפרקי נוצרת בעיקר מרשת קולגן מסוג II היוצרת ארקייד, ה- IVD מורכב משלושה סוגים שונים של רקמות: פולפוס הגרעין העשיר בקולגן II במרכז תופס עומסים ציריים ומעביר אותם לטבעת מקיפה של סיבי קולגן עגולים מסוג I צפופים הנקראים סינולוס סיביים. תפקידם הוא לספוג את הלחצים הארזיים המתורגמים המתקבלים על ידי הגרעין הפרוטאוגליקני והעשיר במים עם חוזק הסיבים האורך המתוח שלהם. בחלק העליון והתחתון של כל גרעין ואנולוס, לוחית קצה קרטלגינית היאלין יוצרת את הצומת לחוליות הסמוכות4 (איור 1).
בסחוס מפרקי ניתן למצוא ארבעה דפוסי כונדרוציטים מרחביים נפרדים: זוגות, מחרוזות, מחרוזות כפולות, אשכולות קטנים בהתאמה גדולים5,6,7 ( איור2). שינויים בתבנית זו משויכים להתפרצות OA ולהתקדמות8,9. ארגון chondrocyte מרחבי מעיד גם על מאפיין פונקציונלי ישיר של סחוס, כלומר נוקשותו, הדגיש את הרלוונטיות התפקודית של גישה זו דירוג מבוסס תמונה10,11. דפוסים אלה יכולים גם להיות מזוהים עם טכנולוגיה כבר קיים קליני זמין12. בשל הדמיון בין IVD וסחוס מפרקי, ניתן לשער כי דפוסי chondrocyte אופייניים נמצאים גם בעירוי. היווצרות אשכול היא תופעה שנצפתה גם בהבחנה מנוונת13,14.
כאשר מנסים לנתח ארגון סלולרי מרחבי בעירוי, יש צורך להתגבר על מספר קשיים טכניים שאינם קיימים בעת חקירת סחוס מפרקי:
ראשית, עיבוד הרקמה עצמה הוא הרבה יותר מאתגר מאשר עם סחוס היאלין הומוגני אשר מורכב בעיקר קולגן סוג II. רכיב הסיבים העיקרי של ה-IVD הוא קולגן מסוג I, מה שמקשה הרבה יותר על יצירת מקטעים היסטולוגיים דקים. בעוד בסחוס מפרקי היאלין אפילו חלקים עבים ניתן לנתח בקלות בשל אופי “דמוי זכוכית” של הרקמה, סוג הקולגן I רשת של IVD הוא אופטי מאוד בלתי חדיר. מסיבה זו, רעש רקע חזק הוא בעיה נפוצה בהצטולוגיה של IVD. דרך מהירה וזולה לחדור לרקמה צפופה אופטית זו היא שימוש במכשיר חתך אופטי למשל, באמצעות אפופוטם. באפוטום כזה, רשת מוכנסת במסלול התאורה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי. מול הרשת מונחת צלחת זכוכית מקבילה למטוס. פעולה זו נוטה קדימה ואחורה ובכך מקרינת את הרשת בתמונה בשלושה מיקומים שונים. עבור כל מיקום z, שלוש תמונות גולמיות עם הרשת המוקרנת נוצרות ומונחות על-גבי. באמצעות תוכנה מיוחדת, ניתן לחשב את האור מחוץ למיקוד. העיקרון הבסיסי הוא שאם הרשת גלויה, המידע הזה נמצא במוקד, אם לא הוא נחשב לא ממוקד. עם טכניקה זו, תמונות ממוקדות היטב ברזולוציה גבוהה ניתן לרכוש בפרק זמן סביר.
שנית, קשה להשיג את הרקמה מתורמים אנושיים. בעת ביצוע החלפת ברך מוחלטת, ניתן להשיג את כל פני השטח של המפרק לניתוח נוסף במהלך הניתוח. למרות דלקת מפרקים ניוונית של מפרק diarthrodial היא גם מחלה של המפרק כולו, ישנם בכל זאת הבדלים מוקדיים חזקים באיכות הסחוס עם בדרך כלל כמה אזורים של המפרק עדיין להיות שלם, למשל בשל עומס מופחת באזור זה. מצב זה שונה בהפריה הVD, שם הניתוח מבוצע בדרך כלל רק כאשר הדיסק נהרס ברחבי העולם. בעת קבלת רקמות מתורמים אנושיים מחדר הניתוח, הרקמה גם מקוטעת מאוד ויש צורך להקצות כראוי את הרקמה לאחד משלושת סוגי הסחוס של ה- IVD לפני ביצוע ניתוחים נוספים. כדי לאפשר ניתוחים מפורטים יותר של קטעי רקמות גדולים יותר ולבדוק את ההתפתחות העוברית של IVD הבחירה של אורגניזם מודל בעלי חיים היא, אם כן, הכרחית.
בעת בחירת אורגניזם מודל כזה חשוב שתהיה מערכת הדומה לדיסק האנושי ביחס לאנטומיה ומידותיו, העמסה המכנית שלו, אוכלוסיית התא הנוכחית כמו גם הרכב הרקמה שלה. לצורך הטכניקה המוצגת כאן אנו מציעים את השימוש ברקמת דיסק מותני בקר: מאפיין קריטי של הדיסק האנושי וכתוצאה מכך הפוטנציאל ההתחדשותי הנמוך שלו הוא אובדן תאים לא-רדודליים במהלך ההבשלה בגרעין. עם זאת, במודלים רבים אורגניזמים notochordal תאים ניתן לזהות כל חייהם. לרוב בעלי החיים המעטים שמאבדים את התאים הלא-נוכרודים שלהם כמו כבשים, עזים או כלבי כונדרודיסטרופיג יש IVD שהוא קטן בהרבה מדיסקים אנושיים. רק דיסקים מותניים של בקר נוכחים עם קוטר דיסק קשתי דומה לאלה של IVDs אנושי15.
גורם מפתח המוביל לניוון דיסק מוקדם הוא טעינה מכנית מוגזמת. הלחצים התוך-ממדיים של פרה עומדת בעמוד השדרה המותני הם בסביבות 0.8 MPa כשעמוד השדרה מיושר אופקית. באופן מפתיע לחצים אלה דומים ללחצים התוך-דיקליים המותניים שדווחו לעמוד השדרה האנושי הזקוף (0.5 MPa)15,16. גם כמות המים ופרוטוגליקנים בדיסקים של בקר דומה לזו של ה- IVD מבני אדם צעירים17. לכן, למרות שדפוס התנועה בפועל של מקטעי התנועה עשוי להיות שונה בבעלי חיים מרובעים מהאדם הדו-רגליים, ביחס למאפייני הטעינה והדיסק הכוללים, הפרה קרובה הרבה יותר לביולוגיה האנושית מאשר מודלים בעלי חיים מבוססים אחרים עבור IVD כגון כבשים וכלבים.
בפרוטוקול זה אנו מציגים טכניקה כיצד לנתח שינויים בהפריה חוץ גופית מנקודת המבט של ארגון כונדרוציטים מרחבי מהתפתחות עוברית מוקדמת ועד ניוון שלב הסיום.
Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות מוגברת על ידי הדמיית פסיפס וחתך אופטי, הערכנו את הסידור המרחבי של כונדרוציטים באנולוס של IVD המותני לאורך כל הפיתוח, ההתבגרות, ניוון. בעוד רקמות ניווניות ניתן לקצור מחולים שקיבלו ניתוח עמוד השדרה עבור ניוון דיסק, ניתוח של התקופה העוברית ושלב ההתבגרות נדר…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למחברים השותפים שלנו מהפרסומים המקוריים על עזרתם ותמיכתם. אנו מודים לשרלוט אמה במברגר על שעזרה להשיג את תמונות האפוטום.
Materials
| Amphotericin B | Merck KGaA, Germany | A2942 | |
| Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus | R. Langenbrinck, Germany | 03-0060 | |
| ApoTome | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 462000115 | |
| AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | ||
| CellMask Actin Tracking Stain | Thermo Fischer Scientific, US | A57249 | |
| Cryostat | Leica Biosystems, US | CM3050S | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific, US | D1306 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Germany | 41966052 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich, US | 60004 | |
| Fluorescence Miscoscope – Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 3834000604 | |
| Formaldehyde | Merck KGaA, Germany | 104002 | |
| Image J 1.53a, with Cell counter plugin | National Insittute of Health (NIH), US | ||
| Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | Thermo Fischer Scientific, US | A12380 | |
| Microscopic Cover Glasses | R. Langenbrinck, Germany | 01-1818/1 | |
| PAP Pen Liquid Blocker | Science Sevices GmbH, Germany | N71310 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, US | P4333 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,US | P5119 | |
| Scalpel | pf medical AG, Germany | 2023-01 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Netherlands | SA6255012 |
Referências
- Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
- Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004).
- Pye, S. R., et al. Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing. Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).
- Humzah, M. D., Soames, R. W. Human intervertebral disc: structure and function. The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Felka, T., et al. Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Aicher, W. K., Rolauffs, B. The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
- Ciapetti, G., et al. Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, 10 (2012).
- Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation. Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).
- Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).
- Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine. 24 (8), 755-762 (1999).
- Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine. 29 (24), 2793-2799 (2004).
- Hofmann, U. K., et al. Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).
- Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 26 (17), 1873-1878 (2001).
- Habermehl, K. H. . Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , (1975).
- Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).
- Bonnaire, F. C., et al. The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).
- Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring. Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).
- Ott, A. Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).
- Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1. American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).
- Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).
- Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
- Johnson, W. E., Roberts, S. Rumours of my death may have been greatly exaggerated’: a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy. Biochemical Society Transactions. 35, 680-682 (2007).
- Roberts, S. Disc morphology in health and disease. Biochemical Society Transactions. 30, 864-869 (2002).
- Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair. Spine Research. 03, 15 (2017).
- Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).
- Freemont, A. J. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology. 48 (1), 5-10 (2009).
- Müllers, Y., et al. Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation. PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).
- McCann, M. R., Séguin, C. A. Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration. Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).
