Etiquetado inmunofluorescente de virus vegetales y proteínas vectoras de insectos en intestinos hemípteros
Summary
Este protocolo para el etiquetado inmunofluorescente de proteínas de virus vegetales y proteínas de insectos vectores en intestinos de insectos extirpados se puede utilizar para estudiar las interacciones entre virus e insectos vectores, las funciones de las proteínas de insectos y los mecanismos moleculares subyacentes a la transmisión del virus.
Abstract
La mayoría de los virus vegetales en la naturaleza se transmiten de una planta a otra por insectos hemípteros. Una alta densidad de población de insectos vectores que son altamente eficientes en la transmisión de virus juega un papel clave en las epidemias de virus en los campos. El estudio de las interacciones entre vectores virus-insectos puede avanzar en nuestra comprensión de la transmisión de virus y las epidemias con el objetivo de diseñar nuevas estrategias para controlar los virus de las plantas y sus insectos vectores. El etiquetado de inmunofluorescencia se ha utilizado ampliamente para analizar las interacciones entre patógenos y huéspedes y se usa aquí en el saltamontes de lomo blanco (WBPH, Sogatella furcifera), que transmite eficientemente el virus enano rayado negro del arroz del sur (SRBSDV, género Fijivirus, familia Reoviridae), para localizar los viriones y las proteínas de insectos en las células epiteliales del intestino medio. Usando microscopía confocal de barrido láser, estudiamos las características morfológicas de las células epiteliales del intestino medio, la localización celular de proteínas de insectos y la colocalización de viriones y una proteína de insecto. Este protocolo se puede utilizar para estudiar las actividades virales en insectos, las funciones de las proteínas de los insectos y las interacciones entre el virus y el insecto vector.
Introduction
La mayoría de los virus vegetales descritos son transmitidos por insectos del orden Hemíptera que incluye pulgones, moscas blancas, saltahojas, saltamontes y trips 1,2. Las piezas bucales perforadoras y chupadoras de los insectos hemípteros perforan el tejido vegetal para alimentar y secretar saliva, transmitiendo el virus de manera concomitantemente eficiente2. Se han descrito diferentes mecanismos de transmisión de virus vegetales por insectos vectores. Estos incluyen no persistente, semipersistente y persistente. El tipo persistente es no propagativo o propagativo3,4, pero para ambos tipos, el virus transmitido debe moverse por todo el cuerpo del insecto. En el modo persistente-propagativo, los virus inicialmente infectan y se replican en las células epiteliales del intestino del insecto, luego se diseminan en diferentes tejidos y, finalmente, en las glándulas salivales, desde donde pueden introducirse en una planta a través de la saliva durante la alimentación de insectos 5,6. Los virus de transmisión persistente se mueven a través de diferentes órganos y se replican en sus insectos vectores, lo que requiere interacciones específicas entre el virus y los componentes del vector en diferentes etapas 7,8.
Las proteínas virales y las proteínas de insectos deben interactuar para facilitar procesos críticos para el reconocimiento, infección, replicación o diseminación del virus en los insectos vectores 9,10. Aunque la microscopía óptica se puede utilizar para observar estructuras celulares en insectos, no puede mostrar la distribución del virión, la localización celular o la colocalización de proteínas virales y proteínas de insectos, o la ultraestructura de los tejidos y células de insectos. El marcado de inmunofluorescencia fue realizado por primera vez por Coons et al. en las células fagocíticas del ratón mediante el etiquetado de anticuerpos específicos contra la fluoresceína, y ahora se usa ampliamente11. La técnica de inmunofluorescencia, también conocida como técnica de anticuerpos de fluorescencia, es una de las primeras técnicas de marcaje inmunológico desarrolladas y se basa en la reacción de unión específica entre el antígeno y el anticuerpo11,12. El anticuerpo conocido se marca primero con fluoresceína, que se utiliza como sonda para detectar los antígenos correspondientes en las células o tejidos13,14. Después de que el anticuerpo marcado con fluoresceína se une al antígeno correspondiente en células o tejidos, la sonda emitirá fluorescencia brillante cuando se irradie con longitudes de onda de excitación y se vea con un microscopio de fluorescencia para localizar el antígeno15.
La mayoría de los insectos vectores de virus de plantas son hemípteros. Una mayor densidad de población de insectos vectores que tienen una alta eficiencia de transmisión para el virus de la planta puede conducir a epidemias de virus5. El virus enano rayado negro del arroz del sur (SRBSDV, género Fijivirus, familia Reoviridae), uno de los patógenos más graves del arroz, se ha extendido rápidamente por las zonas productoras de arroz en Asia oriental y sudoriental, y ha causado graves pérdidas de rendimiento desde 201016,17. Los adultos y las ninfas del saltamontes dorsiblanco (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) transmiten el SRBSDV al arroz de manera persistente-propagativa con alta eficiencia. Los estudios de campo han demostrado que los brotes de enfermedad enana rayada negra inducida por SRBSDV suelen coincidir con la migración masiva a larga distancia de WBPH, un factor crucial en las epidemias de SRBSDV 7,8,18. La proteína de membrana 7 asociada a vesicle (VAMP7) es un receptor soluble de proteína de unión al factor sensible a N-etilmaleimida (SNARE), que puede mediar el transporte de sustancias a través de la fusión de vesículas. VAMP7 interactúa con la proteína de la cápside principal externa del SRBSDV in vitro, lo que indica que VAMP7 podría estar estrechamente asociada con la transmisión del virus16.
En el protocolo presentado aquí, extirpamos el intestino de WBPH virulifero como ejemplo para etiquetar viriones SRBSDV y VAMP7 en células epiteliales del intestino medio16. Como el sitio de invasión inicial del virus, el epitelio del intestino medio juega un papel vital en la infección, replicación y transmisión del virus. Primero, detallamos los pasos para extirpar el intestino de las ninfas y adultos de WBPH. En segundo lugar, utilizamos anticuerpos específicos marcados con fluoresceína para marcar los viriones SRBSDV y VAMP7 en células epiteliales intestinales. Luego observamos las células epiteliales y la ubicación celular de los viriones y VAMP7 a través de un microscopio confocal de barrido láser. Los resultados mostraron que los viriones SRBSDV y VAMP7 podrían colocalizarse en el citoplasma de las células epiteliales del intestino medio, lo que sugiere que la función específica de VAMP7 podría estar relacionada con la diseminación de viriones de las células epiteliales del intestino medio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para obtener los mejores resultados, se deben considerar algunos puntos clave. En primer lugar, es necesaria una alta proporción de insectos virulíferos entre la población total. Aunque el AAP mínimo para SRBSDV por ninfas y adultos de WBPH es de 5 min17, se debe permitir que los insectos se alimenten de plantas de arroz frescas infectadas con SRBSDV durante 2 d para lograr una eficiencia de adquisición de hasta el 80%. Dado que los viriones SRBSDV se pueden detectar en el 80% de los intestin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31630058 a X.W. y 31772134 a W.L.).
Materials
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
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