Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts
Summary
절제된 곤충 내장에서 식물 바이러스 단백질과 벡터 곤충 단백질 모두의 면역형광 표지를 위한 이 프로토콜은 바이러스와 벡터 곤충 간의 상호 작용, 곤충 단백질 기능 및 바이러스 전파의 기초가 되는 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
자연계의 대부분의 식물 바이러스는 hemipteran 곤충에 의해 한 식물에서 다른 식물로 전염됩니다. 바이러스 전파에 매우 효율적인 벡터 곤충의 높은 개체군 밀도는 현장에서 바이러스 전염병에 중요한 역할을 합니다. 바이러스-곤충 벡터 상호 작용을 연구하면 식물 바이러스와 그 벡터 곤충을 제어하기 위한 새로운 전략을 설계하기 위해 바이러스 전파 및 전염병에 대한 이해를 높일 수 있습니다. 면역형광 표지는 병원체와 숙주 간의 상호작용을 분석하는 데 널리 사용되어 왔으며, 중장 상피 세포에서 비리온과 곤충 단백질을 찾기 위해 남부 쌀 검은 줄무늬 왜성 바이러스(SRBSDV, 피지바이러스 속, Reoviridae과)를 효율적으로 전달하는 흰등받이 식물호(WBPH, Sogatella furcifera)에서 사용됩니다. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 중장 상피 세포의 형태학적 특성, 곤충 단백질의 세포 국소화, 비리온과 곤충 단백질의 공동 국소화를 연구했습니다. 이 프로토콜은 곤충의 바이러스 활동, 곤충 단백질의 기능, 바이러스와 벡터 곤충 간의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
대부분의 기술 된 식물 바이러스는 진딧물, 흰 파리, 딱정벌레, 식물 호퍼 및 thrips 1,2를 포함하는 Hemiptera 목의 곤충에 의해 전염됩니다. hemipteran 곤충의 피어싱 빨아 먹는 입 부분은 타액을 먹이고 분비하기 위해 식물 조직을 관통하여 바이러스를 효율적으로 전염시킵니다2. 벡터 곤충에 의한 식물 바이러스의 다양한 전염 메커니즘이 설명되었습니다. 여기에는 비지속적, 반지속적 및 영구가 포함됩니다. 영구 유형은 비 전파 성 또는 전파성 3,4이지만,이 두 유형 모두에 대해 전염 된 바이러스는 곤충의 몸 전체로 이동해야합니다. 영구 전파 모드에서, 바이러스는 처음에는 곤충의 내장의 상피 세포에서 감염 및 복제 된 다음 다른 조직으로 퍼지고 결국에는 타액선으로 퍼져 곤충 먹이 동안 타액을 통해 식물에 도입 될 수 있습니다 5,6. 지속성 전염 바이러스는 서로 다른 기관을 통해 이동하고 곤충 벡터에서 복제되며, 이는 서로 다른 단계에서 바이러스와 벡터 구성 요소 간의 특정 상호 작용을 필요로 합니다 7,8.
바이러스 단백질과 곤충 단백질은 벡터 곤충에서 바이러스 인식, 감염, 복제 또는 보급을 위한 중요한 과정을 촉진하기 위해 상호 작용해야 합니다 9,10. 광학 현미경은 곤충의 세포 구조를 관찰하는 데 사용할 수 있지만 비리온 분포, 바이러스 단백질과 곤충 단백질의 세포 국소화 또는 공동 국소화, 곤충 조직 및 세포의 미세 구조를 보여줄 수 없습니다. 면역형광 표지는 Coons et al.에 의해 특이적 플루오레세인 항체를 표지하는 방법으로 마우스의 식세포에서 처음 수행되었으며 현재는 널리 사용되고 있다11. 형광 항체 기술로도 알려진 면역 형광 기술은 개발 된 최초의 면역 학적 표지 기술 중 하나이며 항원과 항체11,12 사이의 특이 적 결합 반응을 기반으로합니다. 공지된 항체는 먼저 플루오레세인으로 표지되며, 이는 세포 또는 조직13,14에서 상응하는 항원을 검출하기 위한 프로브로서 사용된다. 플루오레세인 표지 항체가 세포 또는 조직의 해당 항원에 결합한 후 여기 파장을 조사하고 형광 현미경으로 볼 때 프로브는 밝은 형광을 방출하여 항원을 국소화합니다15.
식물 바이러스의 대부분의 벡터 곤충은 hemipterans입니다. 식물 바이러스에 대한 전염 효율이 높은 벡터 곤충의 개체군 밀도가 높을수록 바이러스 전염병이 발생할 수 있다5. 벼의 가장 심각한 병원균 중 하나인 남방벼 흑줄무늬난쟁이 바이러스(SRBSDV, 피지바이러스 속, Reoviridae과)는 동아시아와 동남아시아의 벼 재배 지역에 빠르게 퍼져 2010년 이후 심각한 수확량 손실을 초래했습니다16,17. 흰등받이식물호퍼(WBPH, Sogatella furcifera Horváth)의 성충과 님프는 SRBSDV를 고효율로 지속적으로 번식하는 방식으로 벼에 전달합니다. 현장 연구에 따르면 SRBSDV에 의해 유발된 벼 검은 줄무늬 왜소병의 발병은 일반적으로 SRBSDV 전염병의 중요한 요소인 WBPH의 대규모 장거리 이동과 일치합니다 7,8,18. VESICLE-associated membrane protein 7(VAMP7)은 소포 융합을 통해 물질의 수송을 매개할 수 있는 가용성 N-에틸말레이미드 민감 인자 부착 단백질 수용체(SNARE)입니다. VAMP7은 시험관 내에서 SRBSDV의 외부 주요 캡시드 단백질과 상호 작용하며, 이는 VAMP7이 바이러스 전파와 밀접하게 연관되어 있음을 나타냅니다16.
여기에 제시된 프로토콜에서 우리는 중장 상피 세포에서 SRBSDV 비리온과 VAMP7을 표지하기 위한 예로 독성 WBPH에서 장을 절제했습니다16. 바이러스의 초기 침입 부위인 중장 상피는 바이러스 감염, 복제 및 전파에 중요한 역할을 합니다. 먼저, 우리는 WBPH의 님프와 성인의 내장을 절제하는 단계를 자세히 설명했습니다. 둘째, 특정 플루오레세인 표지 항체를 사용하여 장 상피 세포에서 SRBSDV 비리온과 VAMP7을 표지했습니다. 그런 다음 레이저 주사 컨포칼 현미경을 통해 상피 세포와 비리온 및 VAMP7의 세포 위치를 관찰했습니다. 결과는 SRBSDV 비리온과 VAMP7이 중장 상피 세포의 세포질에서 공동 국소화될 수 있음을 보여주었으며, 이는 VAMP7의 특정 기능이 중장 상피 세포에서 비리온의 보급과 관련이 있을 수 있음을 시사합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
최상의 결과를 얻으려면 몇 가지 핵심 사항을 고려해야 합니다. 첫째, 전체 인구 중 독성 곤충의 비율이 높아야합니다. WBPH 님프와 성인에 의한 SRBSDV의 최소 AAP는 5 분17 초이지만, 곤충은 최대 80 %의 획득 효율을 달성하기 위해 2 일 동안 신선한 SRBSDV에 감염된 벼를 먹일 수 있어야합니다. SRBSDV 비리온은 중장18의 80%에서 검출될 수 있기 때문에, 우리는 이 프로토?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (National Natural Science Foundation of China)의 보조금으로 지원되었습니다 (31630058에서 X.W.로, 31772134에서 WL로).
Materials
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
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