הזרקת וריד פורטל של אורגנואידים מסרטן המעי הגס (CRC) יוצרת גרורות כבד עשירות בסטרומה. מודל עכבר זה של גרורות כבד CRC מייצג כלי שימושי לחקר אינטראקציות בין גידול לסטרומה ולפיתוח טיפולים חדשניים המכוונים לסטרומה כגון טיפולים גנטיים בתיווך וירוסים הקשורים לאדנו.
גרורות בכבד של סרטן המעי הגס (CRC) הן הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן. פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs), מרכיב מרכזי במיקרו-סביבה של הגידול, ממלאים תפקיד מכריע בהתקדמות CRC גרורתית ומנבאים פרוגנוזה לקויה של המטופלים. עם זאת, חסרים מודלים משביעי רצון של עכברים כדי לחקור את ההצלבה בין תאים סרטניים גרורתיים לבין CAFs. כאן אנו מציגים שיטה לחקור כיצד התקדמות גרורות בכבד מווסתת על ידי הנישה הגרורתית וייתכן שניתן לרסן אותה על ידי טיפול מכוון סטרומה. הזרקת ורידים פורטלית של אורגנואידים CRC יצרה תגובה דסמופלסטית, אשר שחזרה בנאמנות את ההיסטולוגיה העשירה בפיברובלסטים של גרורות כבד CRC אנושיות. מודל זה היה ספציפי לרקמות עם עומס גידול גבוה יותר בכבד בהשוואה למודל הזרקה תוך-טחולית, מה שמפשט את ניתוחי ההישרדות של העכברים. על ידי הזרקת אורגנואידים של גידולים המבטאים לוציפראז, ניתן היה לנטר קינטיקה של גדילת הגידול על ידי הדמיית in vivo . יתר על כן, מודל פרה-קליני זה מספק פלטפורמה שימושית להערכת היעילות של טיפולים המכוונים למזנכים של הגידול. אנו מתארים שיטות לבחון אם העברה בתיווך נגיף הקשור לנגיף של גן סטרומלי מעכב גידול להפטוציטים יכולה לשפץ את המיקרו-סביבה של הגידול ולשפר את הישרדות העכברים. גישה זו מאפשרת פיתוח והערכה של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לעיכוב גרורות בכבד של CRC.
סרטן המעי הגס (CRC) הוא הגורם העיקרי לתמותה מסרטן ברחבי העולם1. יותר ממחצית מחולי ה-CRC מפתחים גרורות בכבד המתרחשות באמצעות הפצת וריד הפורטל1. נכון לעכשיו, אין טיפולים יעילים שיכולים לרפא גרורות מתקדמות בכבד, ורוב החולים נכנעים למחלה גרורתית.
הנישה הגרורתית או המיקרו-סביבה של הגידול ממלאת תפקיד מפתח בהשתקה ובצמיחה של תאי CRC מופצים2. פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs), מרכיב בולט במיקרו-סביבה של הגידול, מקדמים או מרסנים את התקדמות הסרטן באמצעות הפרשת גורמי גדילה, שיפוץ המטריצה החוץ-תאית (ECM) וויסות נופי מערכת החיסון והאנגיוגנזה 3,4,5. CAFs גם מעניקים עמידות לכימותרפיה ולאימונותרפיות3. יתר על כן, CAFs מווסתים את ההתחלה וההתקדמות של גרורות בכבד CRC ומנבאים פרוגנוזה בחולים עם CRC 3,6,7,8. לפיכך, גורמים הקשורים ל- CAF יכולים להיות מנוצלים לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות לעיכוב גרורות בכבד CRC. עם זאת, היעדר מודלים משביעי רצון של עכברים לחקר סטרומה של הגידול הגרורתי היווה מכשול מרכזי לפיתוח טיפולים ממוקדי סטרומה.
נכון לעכשיו, מודלים של בעלי חיים לחקר גרורות בכבד CRC כוללים מודלים ראשוניים של CRC המפתחים באופן ספונטני גרורות בכבד ומודלים של השתלת תאים סרטניים לתוך הכבד. מודלים ראשוניים של עכברי CRC, כגון מודלים של עכברים מהונדסים גנטית והזרקה מעי גסה של תאים סרטניים, מראים רק לעתים רחוקות גרורות לכבד 9,10,11,12. יתר על כן, גם אם נצפתה גרורתה בכבד, מודלים אלה מראים חביון ארוך מהאינדוקציה של הגידול הראשוני ועד גרורות, ועלולים למות מנטל הגידול הראשוני12. כדי ליצור ביעילות גרורות בכבד CRC, תאי CRC בתרבית מושתלים בכבד באמצעות שלוש גישות הזרקה: הזרקה תוך-הטחולית, הזרקה תוך-פרנכימית ישירה לתוך הכבד והזרקת וריד פורטלי. תאים סרטניים שהוזרקו באופן תוך-ספלני התפשטו לווריד הטחול, לווריד הפורטלי, ובסופו של דבר לכבד13,14. עם זאת, הזריקה התוך-טחולית מניבה יחס נטילת גידול נמוך יותר בהשוואה למודלים אחרים של השתלה15,16. עם הזרקה תוך-טחולית, הסרה כירורגית של הטחול מבוצעת כדי למנוע צמיחת סרטן בטחול, מה שעלול לפגוע בהבשלת תאי מערכת החיסון17. יתר על כן, הזרקה תוך-טחולית יכולה גם לגרום לצמיחה לא מכוונת של הגידול בטחול ובחלל הבטן18, מה שמסבך את ניתוחי הגרורות בכבד. הזרקה תוך-פרנכימלית ישירה לתוך הכבד גורמת ביעילות לגרורות בכבד 16,19,20. עם זאת, גישה זו אינה משחזרת באופן מלא שלב ביולוגי של גרורות בכבד המתרחש באופן טבעי באמצעות הפצת ורידים בפורטל. באמצעות הזרקה ישירה לתוך הכבד, כניסה של תאים סרטניים לתוך לא פורטל, אבל מחזור הדם המערכתי יכול גם לגרום למספר גרורות ריאה גדולות16. למרות שרוב החולים עם גרורות בכבד CRC מראים מספר גושים של גידולים בכבד21, הזרקה ישירה לאונת כבד ספציפית מייצרת מסת גידול אחת19,20. הזרקת וריד פורטלי או הזרקת ורידים מזנטריים, למרות שהיא מאתגרת מבחינה טכנית, מאפשרת העברה יעילה של תאי גידול לתוך הכבד באופן שמשחזר את דפוסי הגדילה שנראו בחולים17. אסטרטגיה זו יכולה למזער את האפשרות של גרורות באתר משני ומאפשרת צמיחה מהירה של תאים סרטניים בכבד, תוך פישוט ניתוחי הישרדות של עכברים.
מבחינה היסטורית, קווי תאים של סרטן המעי הגס כגון עכבר MC-38, HT-29 אנושי ו- SW-620 שימשו ליצירת מודלים של עכברים של גרורות בכבד22,23. עם זאת, קווי תאים אלה של סרטן המעי הגס אינם גורמים לתגובה סטרומלית דסמופלסטית. תכולה סטרומלית נמוכה בגידולים מקשה על חקר התפקידים הביולוגיים של פיברובלסטים הקשורים לסרטן. ההתקדמות האחרונה באורגנואידים של CRC ובהשתלתם הציעה פלטפורמות שימושיות להערכת תפקידים חיוניים של הסטרומה בהתקדמות הסרטן24. השתלת כבד של אורגנואידים CRC מייצרת מיקרו-סביבה של גידול עשיר בפיברובלסטים וסיפקה תובנות חדשניות על מחקר סטרומלי 6,25. נכון לעכשיו, הזרקת ורידים פורטלית או מזנטרית של אורגנואידים הפכה לגישה סטנדרטית זהב ליצירת גרורות בכבד CRC 6,25,26,27,28. עם זאת, למיטב ידיעתנו, אף מאמר קודם לא תיאר שיטות מפורטות להזרקת ורידים פורטליים של גידולים במעי הגס. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה לשימוש בהזרקת ורידים פורטלית של אורגנואידים מסוג CRC כדי לפתח טיפול חדשני בהכוונת סטרומה בתיווך נגיף אדנו (AAV).
הפטוציטים הם מרכיב חשוב של המיקרו-סביבה של הגידול הגרורתי בכבד וממלאים תפקיד קריטי בהתקדמות סרטן גרורתי29. בהשראת ההצלחה של גישות ריפוי גנטי AAV להשראת ביטוי חלבונים בהפטוציטים בחולים שאינם ניאופלסטיים30,31, חקרנו גישה דומה אך מכוונת לשנות את המיקרו-סביבה של גידולי הכבד ב-CRC25. ככזה, אנו מתארים כאן גם את הזרקת וריד הזנב של AAV8 כדי לגרום לביטוי של חלבונים אנטי-סרטניים כדי לשנות את המיקרו-סביבה של גידולי הכבד. הסרוטיפ AAV8, המיועד על ידי בחירה של חלבון קפסיד נגיפי במהלך ייצור הנגיף, מוביל ליעילות טרנסדוקציה גבוהה במיוחד של הפטוציטים (כלומר, ביטוי גנים ממוקד במיקרו-סביבה של גידולי הכבד)32. בעבר הראינו כי Islr (משפחת-על אימונוגלובולינים המכילה חזרה עשירה בלאוצין) הוא גן ספציפי ל-CAF המעורר איתות של חלבון מורפוגנטי בעצמות (BMP), מפחית את צמיחת הגידולים של CRC ומקדם התמיינות תאי גזע במעיים Lgr5+ 25. בדקנו אם ביטוי יתר בתיווך AAV8 של הגן הסטרומלי מרסן הסרטן, Islr, בהפטוציטים יכול להחליש את התקדמות גרורות הכבד על ידי ביצוע הזרקת ורידים פורטליים של גידולי CRC בעכברים שטופלו ב-AAV8-Islr.
במאמר זה, אנו מתארים לראשונה את הליך הזרקת ורידי הזנב של AAV טרופי כבד. לאחר מכן, אנו מתארים שיטה להכנת תאים סרטניים והזרקת ורידים פורטליים לעכברים שטופלו ב-AAV. לבסוף, אנו מציגים גישות לניטור התקדמות הגידול הגרורתי כדי להעריך את היעילות של טיפולים מכווני סטרומה.
במחקר זה, הראינו כי הזרקת ורידים פורטליים של אורגנואידים CRC של עכברים יוצרת באופן משוחזר גרורות כבד עשירות בפיברובלסטים המחקות תכונות היסטולוגיות של גרורות כבד CRC אנושיות. יתר על כן, בשילוב עם טיפולים מכווני סטרומה כגון ריפוי גנטי בתיווך AAV8, מודל פרה-קליני זה משמש ככלי שימושי להערכת השפעות…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (APP1156391 ל- D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 עד D.L.W., APP1140236 עד S.L.W., APP1099283 עד D.L.W.,); מועצת הסרטן SA ניצחה את פרויקט הסרטן בשם התורמים שלה וממשלת המדינה של דרום אוסטרליה באמצעות מחלקת הבריאות (MCF0418 ל- S.L.W., D.L.W.); מענק סיוע למחקר מדעי (B) (20H03467 ל- M.T.) שהוזמן על ידי משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן; AMED-CREST (הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי, מחקר ליבה למדע וטכנולוגיה אבולוציונית (19gm0810007h0104 ו- 19gm1210008s0101 עד A.E.); הפרויקט לחקר הסרטן ואבולוציה טיפולית (P-CREATE) מ- AMED (19cm0106332h0002 עד A.E.); האגודה היפנית לקידום המדע בחו”ל תוכנית אתגר לחוקרים צעירים (ל- H.K.), מלגת קרן טקדה למדע (ל- H.K.), מלגת הדוקטורט הבינלאומית של גרייטון (ל- H.K.), מלגת קרן המחקר הרפואי של ליונס (ל- K.G.).
אנו מודים לד”ר לזק ליסובסקי במתקן להנדסת וקטורים וגנום (VGEF), מכון המחקר הרפואי לילדים (CMRI) (NSW, אוסטרליה) על ייצור וקטורים רקומביננטיים AAV.
10% Formalin | Sigma | HT501128 | |
15 mL centrifuge tube | Corning | 430791 | |
33-gauge needle | TSK | LDS-33013 | For portal vein injection |
4-0 vicryl suture | ETHICON | J494G | |
40-µm cell strainer | Corning | 431750 | |
5 mL Syringe | BD | 302130 | Used to apply saline to the intestine after portal vein injection |
50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
50 mL syringe | TERUMO | SS*50LE | Luer lock syringe for perfusion fixation |
70% Isopropyl alcohol wipe | Briemar | 5730 | |
Anaesthesia machine | Darvall | 9356 | |
αSMA antibody | DAKO | M0851 | Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry |
Buprenorphine | TROY | N/A | ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine |
Cotton buds | Johnson & Johnson | N/A | Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use. |
D-luciferin | Biosynth | L-8220 | |
Electric shaver | Sold by multiple suppliers | ||
Forceps | Sold by multiple suppliers | ||
Hamilton syringe | HAMILTON | 81020 | For portal vein injection |
Heat box (animal warming chamber) | Datesand | MK3 | |
Heat lamp | Sold by multiple suppliers | ||
Hemostatic sponge | Pfizer | 09-0891-04-015 | Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm |
India ink | Talens | 44727000 | |
Injection syringe and needle | BD | 326769 | For tail vein injection |
Islr probe (RNAscope) | ACD | 450041 | |
Isoflurane | Henry Schein | 988-3244 | |
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
Living Image Software | Perkin Elmer | 128113 | |
Matrigel | Corning | 356231 | |
MRI fibrosis tool | N/A | N/A | https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
RNAscope kit | ACD | 322300 | |
Rodent restrainer | Sold by multiple suppliers | ||
Rosa26-Cas9 mouse | The Jackson Laboratory | 024858 | |
Saline | Pfizer | PHA19042010 | |
Scissors | Sold by multiple suppliers | ||
Skin staplers | Able Scientific | AS59028 | 9 mm wound clips |
Stapler applicator | Able Scientific | AS59026 | 9 mm wound clip applicator |
Stapler remover | Able Scientific | AS59037 | Wound clip remover |
Surgical drape | Multigate | 29-220 | |
Surgical gauze | Sentry Medical | GS001 | |
Topical anesthesia cream | EMLA | N/A | EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine |
TrypLE Express | Gibco | 12605028 | Recombinant cell-dissociation enzyme mix |
Y-27632 | Tocris | 1254 |