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Pesquisa do Câncer

Injection veineuse portale d’organoïdes du cancer colorectal pour étudier la métastase hépatique Stroma

Published: September 03, 2021
doi:
10.3791/62630
, , , , , , , , , , , , , , , ,
1Adelaide Medical School,University of Adelaide, 2South Australian Health and Medical Research Institute (SAHMRI), 3Department of Pathology,Nagoya University Graduate School of Medicine, 4Division of Molecular Pathology, Center for Neurological Disease and Cancer,Nagoya University Graduate School of Medicine, 5Department of Gastroenterology, Graduate School of Medicine,The University of Tokyo, 6Translational and Clinical Research Institute,Newcastle University, 7International Center for Cell and Gene Therapy,Fujita Health University

Summary

L’injection veineuse portale d’organoïdes du cancer colorectal (CCR) génère des métastases hépatiques riches en stroma. Ce modèle murin de métastases hépatiques du CCR représente un outil utile pour étudier les interactions tumeur-stroma et développer de nouvelles thérapies dirigées par le stroma telles que les thérapies géniques médiées par le virus adéno-associé.

Abstract

Les métastases hépatiques du cancer colorectal (CCR) sont l’une des principales causes de décès liés au cancer. Les fibroblastes associés au cancer (CAF), une composante majeure du microenvironnement tumoral, jouent un rôle crucial dans la progression du CCR métastatique et prédisent un mauvais pronostic du patient. Cependant, il y a un manque de modèles murins satisfaisants pour étudier la diaphonie entre les cellules cancéreuses métastatiques et les CAF. Ici, nous présentons une méthode pour étudier comment la progression des métastases hépatiques est régulée par la niche métastatique et pourrait éventuellement être contenue par un traitement dirigé par le stroma. L’injection veineuse portale d’organoïdes du CCR a généré une réaction desmoplastique, qui a fidèlement récapitulé l’histologie riche en fibroblastes des métastases hépatiques du CCR humain. Ce modèle était spécifique au tissu avec une charge tumorale plus élevée dans le foie par rapport à un modèle d’injection intra-splénique, simplifiant les analyses de survie de la souris. En injectant des organoïdes tumoraux exprimant la luciférase, la cinétique de croissance tumorale pourrait être surveillée par imagerie in vivo . De plus, ce modèle préclinique fournit une plate-forme utile pour évaluer l’efficacité des thérapies ciblant le mésenchyme tumoral. Nous décrivons des méthodes pour examiner si l’administration par un virus adéno-associé d’un gène stromal inhibiteur de tumeur aux hépatocytes pourrait remodeler le microenvironnement tumoral et améliorer la survie de la souris. Cette approche permet le développement et l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques pour inhiber les métastases hépatiques du CCR.

Introduction

Le cancer colorectal (CCR) est une cause majeure de mortalité par cancer dans le monde1. Plus de la moitié des patients atteints de CCR développent des métastases hépatiques qui se produisent par la dissémination de la veineporte 1. Actuellement, il n’existe aucun traitement efficace capable de guérir les métastases hépatiques avancées, et la plupart des patients succombent à une maladie métastatique.

La niche métastatique ou le microenvironnement tumoral joue un rôle clé dans la greffe et la croissance des cellules CCR disséminées2. Les fibroblastes associés au cancer (CAF), un composant important du microenvironnement tumoral, favorisent ou freinent la progression du cancer en sécrétant des facteurs de croissance, en remodelant la matrice extracellulaire (ECM) et en modulant les paysages immunitaires et l’angiogenèse 3,4,5. Les CAF confèrent également une résistance aux chimiothérapies et aux immunothérapies3. De plus, les CAF régulent l’initiation et la progression des métastases hépatiques du CCR et prédisent le pronostic chez les patients atteints deCCR 3,6,7,8. Ainsi, les facteurs liés au CAF pourraient être exploités pour le développement de stratégies thérapeutiques visant à inhiber les métastases hépatiques du CCR. Cependant, le manque de modèles murins satisfaisants pour étudier le stroma tumoral métastatique a été un obstacle majeur au développement de thérapies ciblées sur le stroma.

Actuellement, les modèles animaux pour étudier les métastases hépatiques du CCR comprennent des modèles primaires de CCR qui développent spontanément des métastases hépatiques et des modèles de transplantation de cellules cancéreuses dans le foie. Les modèles murins primaires du CCR, tels que les modèles murins génétiquement modifiés et l’injection colique de cellules cancéreuses, montrent rarement des métastases au foie 9,10,11,12. De plus, même si une métastase hépatique est observée, ces modèles montrent une longue latence de l’induction de la tumeur primaire à la métastase, et potentiellement mourir de la charge tumorale primaire12. Pour générer efficacement des métastases hépatiques CRC, les cellules CRC cultivées sont transplantées dans le foie en utilisant trois approches d’injection: injection intra-splénique, injection intra-parenchymateuse directe dans le foie et injection de veine porte. Les cellules cancéreuses injectées par voie intra-splénique se propagent dans la veine splénique, la veine porte et, finalement, dans le foie13,14. Cependant, l’injection intra-splénique donne un rapport de prise tumorale inférieur à celui d’autres modèles de transplantation15,16. Avec l’injection intra-splénique, l’ablation chirurgicale de la rate est effectuée pour éviter la croissance du cancer dans la rate, ce qui peut potentiellement compromettre la maturation des cellules immunitaires17. En outre, l’injection intra-splénique peut également entraîner une croissance tumorale involontaire dans la rate et la cavité abdominale18, ce qui complique les analyses de métastases hépatiques. L’injection intra-parenchymateuse directe dans le foie induit efficacement des métastases hépatiques 16,19,20. Néanmoins, cette approche ne récapitule pas complètement une étape biologique de la métastase hépatique qui se produit naturellement par la dissémination de la veine porte. En utilisant l’injection directe dans le foie, l’entrée des cellules cancéreuses dans un non-portail, mais la circulation systémique peut également entraîner plusieurs grandes métastases pulmonaires16. Bien qu’une majorité de patients atteints de métastases hépatiques CRC présentent plusieurs nodules tumoraux dans le foie21, l’injection directe dans un lobe hépatique spécifique génère une seule masse tumorale19,20. L’injection de veine porte ou injection de veine mésentérique, bien que techniquement difficile, permet une livraison efficace des cellules tumorales dans le foie d’une manière qui récapitule les modèles de croissance observés chez les patients17. Cette stratégie peut minimiser la possibilité de métastases au site secondaire et permet une croissance rapide des cellules cancéreuses dans le foie, simplifiant ainsi les analyses de survie des souris.

Historiquement, des lignées cellulaires de cancer colorectal telles que la souris MC-38, le HT-29 humain et le SW-620 ont été utilisées pour générer des modèles murins de métastases hépatiques22,23. Cependant, ces lignées cellulaires de cancer colorectal n’induisent pas de réaction stromale desmoplastique. La faible teneur stromale dans les tumeurs rend difficile l’étude des rôles biologiques des fibroblastes associés au cancer. Les progrès récents dans les organoïdes du CCR et leur transplantation ont offert des plateformes utiles pour évaluer les rôles vitaux du stroma dans la progression du cancer24. La transplantation hépatique d’organoïdes du CCR génère un microenvironnement tumoral riche en fibroblastes et a fourni de nouvelles informations sur la recherchestromale 6,25. Actuellement, l’injection veineuse portale ou mésentérique d’organoïdes est devenue une approche de référence pour générer des métastases hépatiques CRC 6,25,26,27,28. Néanmoins, à notre connaissance, aucun article précédent n’a décrit de méthodes détaillées pour l’injection veineuse porte de tumoroïdes colorectaux. Nous présentons ici une méthodologie pour l’utilisation de l’injection veineuse portale d’organoïdes du CCR pour développer un nouveau traitement dirigé par le stroma médié par le virus adéno-associé (AAV).

Les hépatocytes sont un constituant important du microenvironnement tumoral métastatique dans le foie et jouent un rôle essentiel dans la progression du cancer métastatique29. Inspirés par le succès des approches de thérapie génique AAV pour induire l’expression des protéines dans les hépatocytes chezles patients non néoplasiques 30,31, nous avons étudié une approche similaire mais visant à modifier le microenvironnement de la tumeur du foie dans leCCR 25. En tant que tel, nous décrivons également ici l’injection de veine caudale d’AAV8 pour induire l’expression de protéines anti-tumorigènes afin de modifier le microenvironnement de la tumeur du foie. Le sérotype AAV8, désigné par le choix de la protéine de capside virale lors de la production du virus, conduit à une efficacité de transduction élevée spécifiquement des hépatocytes (c’est-à-dire l’expression génique ciblée dans le microenvironnement de la tumeur hépatique)32. Nous avons déjà montré que Islr (superfamille d’immunoglobulines contenant une répétition riche en leucine) est un gène spécifique du CAF qui induit la signalisation de la protéine morphogénétique osseuse (BMP), réduit la croissance des tumoroïdes du CCR et favorise la différenciation des cellules souches intestinales Lgr5+ 25. Nous avons testé si la surexpression médiée par AAV8 du gène stromal limitant le cancer, Islr, dans les hépatocytes pouvait atténuer la progression des métastases hépatiques en effectuant une injection veineuse porte de tumoroïdes CRC chez des souris traitées par AAV8-Islr.

Dans cet article, nous décrivons d’abord la procédure d’injection de la veine caudale de l’AAV tropicale hépatique. Ensuite, nous décrivons une méthode de préparation de cellules tumoroïdes et d’injection de veine porte chez les souris traitées par AAV. Enfin, nous présentons des approches pour surveiller la progression tumorale métastatique afin d’évaluer l’efficacité des thérapies dirigées par le stroma.

Protocol

Toutes les procédures animales décrites dans cet article ont été examinées et approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Institut de recherche médicale et de santé d’Australie-Méridionale (numéro d’approbation, SAM322). 1. Injection dans la veine caudale du virus adéno-associé REMARQUE : Le virus adéno-associé (VAA) doit être traité comme un risque biologique conformément aux lignes directrices sur le niveau de biosécurité 1. Veuillez…

Representative Results

Pour induire une surexpression médiée par l’AAV d’un gène stromal limitant la tumeur, Islr 4,25,43,44, dans les hépatocytes, nous avons injecté par voie intraveineuse Islr-encodant AAV8. 1,0 x 1011 génomes viraux (vg) d’AAV8-Islr, ou comme témoin, AAV8-mRuby2, ont été injectés dans la veine de la queue de souris adulte (<strong clas…

Discussion

Dans cette étude, nous avons montré que l’injection de veine porte d’organoïdes CRC de souris génère de manière reproductible des métastases hépatiques riches en fibroblastes qui imitent les caractéristiques histologiques des métastases hépatiques CRC humaines. En outre, lorsqu’il est combiné avec des thérapies dirigées par le stroma telles que la thérapie génique médiée par AAV8, ce modèle préclinique constitue un outil utile pour évaluer les effets thérapeutiques sur la survie de la souris e…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue par des subventions du Conseil national de la santé et de la recherche médicale (APP1156391 à D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 à D.L.W., APP1140236 à S.L.W., APP1099283 à D.L.W.,); Cancer Council SA Beat Cancer Project au nom de ses donateurs et du gouvernement de l’État d’Australie-Méridionale par l’intermédiaire du ministère de la Santé (MCF0418 à S.L.W., D.L.W.); une subvention pour la recherche scientifique (B) (20H03467 à M.T.) commandée par le Ministère de l’éducation, de la culture, des sports, des sciences et de la technologie du Japon; AMED-CREST (Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux, Core Research for Evolutional Science and Technology (19gm0810007h0104 et 19gm1210008s0101 à A.E.); le Projet de recherche sur le cancer et l’évolution thérapeutique (P-CREATE) de AMED (19cm0106332h0002 à A.E.); Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (à H.K.), Bourse de la Fondation Takeda science (à H.K.), Bourse de doctorat Greaton International (à H.K.), Bourse de la Fondation de recherche médicale Lions (à K.G.).

Nous remercions le Dr Leszek Lisowski du Vector and Genome Engineering Facility (VGEF), Children’s Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIE) d’avoir produit des vecteurs AAV recombinants.

Materials

10% Formalin Sigma HT501128
15 mL centrifuge tube Corning 430791
33-gauge needle TSK LDS-33013 For portal vein injection
4-0 vicryl suture ETHICON J494G
40-µm cell strainer Corning 431750
5 mL Syringe BD 302130 Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tube Corning 430829
50 mL syringe TERUMO SS*50LE Luer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipe Briemar 5730
Anaesthesia machine Darvall 9356
αSMA antibody DAKO M0851 Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
Buprenorphine TROY N/A ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton buds Johnson & Johnson N/A Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferin Biosynth L-8220
Electric shaver Sold by multiple suppliers
Forceps Sold by multiple suppliers
Hamilton syringe HAMILTON 81020 For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber) Datesand MK3
Heat lamp Sold by multiple suppliers
Hemostatic sponge Pfizer 09-0891-04-015 Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India ink Talens 44727000
Injection syringe and needle BD 326769 For tail vein injection
Islr probe (RNAscope) ACD 450041
Isoflurane Henry Schein 988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
Living Image Software Perkin Elmer 128113
Matrigel Corning 356231
MRI fibrosis tool N/A N/A https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma D8537
RNAscope kit ACD 322300
Rodent restrainer Sold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouse The Jackson Laboratory 024858
Saline Pfizer PHA19042010
Scissors Sold by multiple suppliers
Skin staplers Able Scientific AS59028 9 mm wound clips
Stapler applicator Able Scientific AS59026 9 mm wound clip applicator
Stapler remover Able Scientific AS59037 Wound clip remover
Surgical drape Multigate 29-220
Surgical gauze Sentry Medical GS001
Topical anesthesia cream EMLA N/A EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE Express Gibco 12605028 Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632 Tocris 1254
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Kobayashi, H., Gieniec, K. A., Ng, J. Q., Goyne, J., Lannagan, T. R. M., Thomas, E. M., Radford, G., Wang, T., Suzuki, N., Ichinose, M., Wright, J. A., Vrbanac, L., Burt, A. D., Takahashi, M., Enomoto, A., Worthley, D. L., Woods, S. L. Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma. J. Vis. Exp. (175), e62630, doi:10.3791/62630 (2021).
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