Portal veneinjektion af kolorektal cancer (CRC) organoider genererer stroma-rige levermetastaser. Denne musemodel af CRC-levermetastase repræsenterer et nyttigt redskab til at studere tumor-stroma-interaktioner og udvikle nye stroma-rettede terapier såsom adeno-associerede virusmedierede genterapier.
Levermetastase af kolorektal cancer (CRC) er en førende årsag til kræftrelateret død. Kræftassocierede fibroblaster (CAF’er), en vigtig bestanddel af tumormikromiljøet, spiller en afgørende rolle i metastatisk CRC-progression og forudsiger dårlig patientprognose. Der mangler dog tilfredsstillende musemodeller til at studere krydstalen mellem metastatiske kræftceller og CAF’er. Her præsenterer vi en metode til at undersøge, hvordan levermetastaseprogression reguleres af den metastatiske niche og muligvis kan begrænses af stroma-rettet terapi. Portalveneinjektion af CRC-organoider genererede en desmoplastisk reaktion, som trofast rekapitulerede den fibroblastrige histologi af humane CRC-levermetastaser. Denne model var vævsspecifik med en højere tumorbyrde i leveren sammenlignet med en intra-miltinjektionsmodel, hvilket forenklede museoverlevelsesanalyser. Ved at injicere luciferase-ekspresserende tumororganoider kunne tumorvækstkinetik overvåges ved in vivo-billeddannelse . Desuden giver denne prækliniske model en nyttig platform til at vurdere effekten af terapi rettet mod tumormesenchymet. Vi beskriver metoder til at undersøge, om adeno-associeret virusmedieret levering af et tumorhæmmende stromal-gen til hepatocytter kunne ombygge tumormikromiljøet og forbedre musens overlevelse. Denne tilgang muliggør udvikling og vurdering af nye terapeutiske strategier til at hæmme levermetastase af CRC.
Kolorektal cancer (CRC) er en væsentlig årsag til kræftdødelighed på verdensplan1. Mere end halvdelen af CRC-patienterne udvikler levermetastase, der opstår gennem portalveneformidlingen1. I øjeblikket er der ingen effektive terapier, der kan helbrede avanceret levermetastase, og de fleste patienter bukker under for metastatisk sygdom.
Det metastatiske niche- eller tumormikromiljø spiller en nøglerolle i engraftment og vækst af formidlede CRC-celler2. Kræftassocierede fibroblaster (CAF’er), en fremtrædende komponent i tumormikromiljøet, fremmer eller begrænser kræftprogression gennem udskillelse af vækstfaktorer, ombygning af den ekstracellulære matrix (ECM) og modulering af immunlandskaber og angiogenese 3,4,5. CAF’er giver også resistens over for kemoterapier og immunterapier3. Desuden regulerer CAF’er initiering og progression af CRC-levermetastase og forudsiger prognose hos patienter med CRC 3,6,7,8. CAF-relaterede faktorer kan således udnyttes til udvikling af terapeutiske strategier til at hæmme CRC-levermetastase. Manglen på tilfredsstillende musemodeller til at studere den metastatiske tumor stroma har imidlertid været en stor hindring for at udvikle stroma-målrettede terapier.
I øjeblikket omfatter dyremodeller til undersøgelse af CRC-levermetastase primære CRC-modeller, der spontant udvikler levermetastase og kræftcelletransplantationsmodeller i leveren. Primære CRC-musemodeller, såsom genetisk manipulerede musemodeller og koloninjektion af kræftceller, viser sjældent metastase til leveren 9,10,11,12. Desuden, selvom en levermetastase observeres, viser disse modeller lang latenstid fra den primære tumorinduktion til metastase og dør potentielt af primær tumorbyrde12. For effektivt at generere CRC-levermetastaser transplanteres dyrkede CRC-celler i leveren ved hjælp af tre injektionsmetoder: intra-miltinjektion, direkte intra-parenkym injektion i leveren og portalveneinjektion. Intra-splenisk injicerede kræftceller spredes ind i miltvenen, portalvenen og i sidste ende til leveren13,14. Den intra-miltinjektion giver imidlertid et lavere tumorudtagelsesforhold sammenlignet med andre transplantationsmodeller 15,16. Ved intra-miltinjektion udføres kirurgisk fjernelse af milten for at undgå kræftvækst i milten, hvilket potentielt kan kompromittere immuncellemodningen17. Desuden kan intra-miltinjektion også resultere i utilsigtet tumorvækst i milten og bughulen18, hvilket komplicerer levermetastaseanalyser. Direkte intra-parenkymal injektion i leveren inducerer effektivt levermetastase 16,19,20. Ikke desto mindre rekapitulerer denne tilgang ikke fuldt ud et biologisk trin af levermetastase, der naturligt forekommer gennem portalveneformidling. Ved hjælp af direkte injektion i leveren kan indtrængen af kræftceller i en ikke-portal, men systemisk cirkulation også resultere i flere store lungemetastaser16. Selvom et flertal af patienter med CRC-levermetastase viser flere tumorknuder i leveren21, genererer direkte injektion i en bestemt leverlap en enkelt tumormasse 19,20. Portal veneinjektion eller mesenterisk veneinjektion, selvom det er teknisk udfordrende, muliggør effektiv levering af tumorceller i leveren på en måde, der rekapitulerer de vækstmønstre, der ses hos patienter17. Denne strategi kan minimere muligheden for metastaser på sekundært sted og muliggør hurtig vækst af kræftceller i leveren, hvilket forenkler museoverlevelsesanalyser.
Historisk set blev kolorektal cancer cellelinjer som mus MC-38, human HT-29 og SW-620 brugt til at generere musemodeller af levermetastase22,23. Imidlertid inducerer disse kolorektale kræftcellelinjer ikke en desmoplastisk stromal reaktion. Lavt stromalindhold i tumorerne gør det vanskeligt at undersøge de biologiske roller af kræftassocierede fibroblaster. Nylige fremskridt inden for CRC-organoider og deres transplantation har tilbudt nyttige platforme til at vurdere stromaens vitale roller i kræftprogression24. Levertransplantation af CRC-organoider genererer et fibroblastrigt tumormikromiljø og har givet ny indsigt i stromal forskning 6,25. I øjeblikket er portal eller mesenterisk veneinjektion af organoider blevet en guldstandardmetode til at generere CRC-levermetastase 6,25,26,27,28. Ikke desto mindre har ingen tidligere artikler, så vidt vi ved, beskrevet detaljerede metoder til portalveneinjektion af kolorektale tumoroider. Her præsenterer vi en metode til brug af portalveneinjektion af CRC-organoider til at udvikle ny adeno-associeret virus (AAV)-medieret stroma-rettet terapi.
Hepatocytter er en vigtig bestanddel af det metastatiske tumormikromiljø i leveren og spiller en kritisk rolle i metastatisk kræftprogression29. Inspireret af succesen med AAV-genterapitilgange til at inducere proteinekspression i hepatocytter hos ikke-neoplastiske patienter 30,31 undersøgte vi en lignende tilgang, men havde til formål at ændre levertumormikromiljøet i CRC25. Som sådan beskriver vi også heri haleveneinjektionen af AAV8 for at inducere ekspression af antitumorigene proteiner for at ændre levertumormikromiljøet. AAV8-serotypen, der er udpeget ved valget af viralt capsidprotein under virusproduktion, fører til høj transduktionseffektivitet specifikt af hepatocytter (dvs. målrettet genekspression i levertumormikromiljøet)32. Vi har tidligere vist, at Islr (immunoglobulin superfamilie indeholdende leucinrig gentagelse) er et CAF-specifikt gen, der inducerer knoglemorfogenetisk protein (BMP) signalering, reducerer CRC tumoroid vækst og fremmer Lgr5+ intestinal stamcelledifferentiering25. Vi testede, om AAV8-medieret overekspression af det kræftbegrænsende stromale gen, Islr, i hepatocytter kunne dæmpe udviklingen af levermetastase ved at udføre portalveneinjektion af CRC-tumoroider i AAV8-Islr-behandlede mus.
I dette papir beskriver vi først haleveneinjektionsproceduren for levertropisk AAV. Derefter beskriver vi en metode til tumoroid celleforberedelse og portalveneinjektion i de AAV-behandlede mus. Endelig præsenterer vi tilgange til overvågning af metastatisk tumorprogression for at vurdere effekten af stroma-rettet terapi.
I denne undersøgelse har vi vist, at portalveneinjektion af mus CRC-organoider reproducerbart genererer fibroblastrige levermetastaser, der efterligner histologiske træk ved humane CRC-levermetastaser. Når den kombineres med stroma-rettet terapi såsom AAV8-medieret genterapi, tjener denne prækliniske model desuden som et nyttigt redskab til at vurdere terapeutiske virkninger på museoverlevelse og tumorvækst.
Der er mindst to kritiske trin i protokollen. For det første er det vigtigt at…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Health and Medical Research Council (APP1156391 til D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 til D.L.W., APP1140236 til S.L.W., APP1099283 til D.L.W.,); Cancer Council SA Beat Cancer Project på vegne af sine donorer og delstatsregeringen i South Australia gennem Department of Health (MCF0418 til S.L.W., D.L.W.); et tilskud til videnskabelig forskning (B) (20H03467 til M.T.) bestilt af Japans ministerium for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi AMED-CREST (Japans agentur for medicinsk forskning og udvikling, kerneforskning for evolutionær videnskab og teknologi (19gm0810007h0104 og 19gm1210008s0101 til AE); projektet for kræftforskning og terapeutisk udvikling (P-CREATE) fra AMED (19cm0106332h0002 til AE); Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (til H.K.), Takeda Science Foundation Fellowship (til H.K.), Greaton International Ph.D. Scholarship (til H.K.), Lions Medical Research Foundation Scholarship (til K.G.).
Vi takker Dr. Leszek Lisowski ved Vector and Genome Engineering Facility (VGEF), Children’s Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIA) for at producere rekombinante AAV-vektorer.
10% Formalin | Sigma | HT501128 | |
15 mL centrifuge tube | Corning | 430791 | |
33-gauge needle | TSK | LDS-33013 | For portal vein injection |
4-0 vicryl suture | ETHICON | J494G | |
40-µm cell strainer | Corning | 431750 | |
5 mL Syringe | BD | 302130 | Used to apply saline to the intestine after portal vein injection |
50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
50 mL syringe | TERUMO | SS*50LE | Luer lock syringe for perfusion fixation |
70% Isopropyl alcohol wipe | Briemar | 5730 | |
Anaesthesia machine | Darvall | 9356 | |
αSMA antibody | DAKO | M0851 | Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry |
Buprenorphine | TROY | N/A | ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine |
Cotton buds | Johnson & Johnson | N/A | Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use. |
D-luciferin | Biosynth | L-8220 | |
Electric shaver | Sold by multiple suppliers | ||
Forceps | Sold by multiple suppliers | ||
Hamilton syringe | HAMILTON | 81020 | For portal vein injection |
Heat box (animal warming chamber) | Datesand | MK3 | |
Heat lamp | Sold by multiple suppliers | ||
Hemostatic sponge | Pfizer | 09-0891-04-015 | Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm |
India ink | Talens | 44727000 | |
Injection syringe and needle | BD | 326769 | For tail vein injection |
Islr probe (RNAscope) | ACD | 450041 | |
Isoflurane | Henry Schein | 988-3244 | |
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
Living Image Software | Perkin Elmer | 128113 | |
Matrigel | Corning | 356231 | |
MRI fibrosis tool | N/A | N/A | https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
RNAscope kit | ACD | 322300 | |
Rodent restrainer | Sold by multiple suppliers | ||
Rosa26-Cas9 mouse | The Jackson Laboratory | 024858 | |
Saline | Pfizer | PHA19042010 | |
Scissors | Sold by multiple suppliers | ||
Skin staplers | Able Scientific | AS59028 | 9 mm wound clips |
Stapler applicator | Able Scientific | AS59026 | 9 mm wound clip applicator |
Stapler remover | Able Scientific | AS59037 | Wound clip remover |
Surgical drape | Multigate | 29-220 | |
Surgical gauze | Sentry Medical | GS001 | |
Topical anesthesia cream | EMLA | N/A | EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine |
TrypLE Express | Gibco | 12605028 | Recombinant cell-dissociation enzyme mix |
Y-27632 | Tocris | 1254 |