लिवर मेटास्टेसिस स्ट्रोमा का अध्ययन करने के लिए कोलोरेक्टल कैंसर ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल वेन इंजेक्शन
Summary
कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) ऑर्गेनोइड्स का पोर्टल शिरा इंजेक्शन स्ट्रोमा-समृद्ध यकृत मेटास्टेसिस उत्पन्न करता है। सीआरसी हेपेटिक मेटास्टेसिस का यह माउस मॉडल ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन का अध्ययन करने और उपन्यास स्ट्रोमा-निर्देशित चिकित्सीय जैसे एडेनो-संबद्ध वायरस-मध्यस्थता जीन उपचार विकसित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।
Abstract
कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) का यकृत मेटास्टेसिस कैंसर से संबंधित मृत्यु का एक प्रमुख कारण है। कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ), ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का एक प्रमुख घटक, मेटास्टैटिक सीआरसी प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और खराब रोगी के पूर्वानुमान की भविष्यवाणी करते हैं। हालांकि, मेटास्टैटिक कैंसर कोशिकाओं और सीएएफ के बीच क्रॉसस्टॉक का अध्ययन करने के लिए संतोषजनक माउस मॉडल की कमी है। यहां, हम यह जांचने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं कि यकृत मेटास्टेसिस प्रगति को मेटास्टैटिक आला द्वारा कैसे विनियमित किया जाता है और संभवतः स्ट्रोमा-निर्देशित चिकित्सा द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। सीआरसी ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन ने एक डेस्मोप्लास्टिक प्रतिक्रिया उत्पन्न की, जिसने मानव सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस के फाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध हिस्टोलॉजी को ईमानदारी से दोहराया। यह मॉडल इंट्रा-प्लीहा इंजेक्शन मॉडल की तुलना में जिगर में एक उच्च ट्यूमर बोझ के साथ ऊतक-विशिष्ट था, जो माउस अस्तित्व के विश्लेषण को सरल बनाता है। लूसिफेरस-व्यक्त ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स को इंजेक्ट करके, ट्यूमर विकास कैनेटीक्स को विवो इमेजिंग में मॉनिटर किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रीक्लिनिकल मॉडल ट्यूमर मेसेनकाइम को लक्षित करने वाले चिकित्सीय की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एक उपयोगी मंच प्रदान करता है। हम यह जांचने के तरीकों का वर्णन करते हैं कि क्या हेपेटोसाइट्स के लिए ट्यूमर-अवरोधक स्ट्रोमल जीन के एडेनो-संबद्ध वायरस-मध्यस्थता वितरण ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को फिर से तैयार कर सकते हैं और माउस के अस्तित्व में सुधार कर सकते हैं। यह दृष्टिकोण सीआरसी के यकृत मेटास्टेसिस को बाधित करने के लिए उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों के विकास और मूल्यांकन को सक्षम बनाता है।
Introduction
कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) दुनिया भर में कैंसर की मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है। सीआरसी रोगियों के आधे से अधिक यकृत मेटास्टेसिस विकसित करते हैं जो पोर्टल शिरा प्रसार1 के माध्यम से होता है। वर्तमान में, कोई प्रभावी चिकित्सीय नहीं है जो उन्नत यकृत मेटास्टेसिस का इलाज कर सकता है, और अधिकांश रोगी मेटास्टैटिक बीमारी से पीड़ित हैं।
मेटास्टैटिक आला या ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट प्रसारित सीआरसी कोशिकाओं के एनग्राफ्टमेंट और विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाताहै। कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ), ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का एक प्रमुख घटक, विकास कारकों को स्रावित करने, बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) को फिर से तैयार करने और प्रतिरक्षा परिदृश्य और एंजियोजेनेसिस 3,4,5 को संशोधित करने के माध्यम से कैंसर की प्रगति को बढ़ावा देने या रोकने के लिए। सीएएफ भी chemotherapys और immunotherapys 3 के लिए प्रतिरोध प्रदान करतेहैं। इसके अलावा, सीएएफ सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस की दीक्षा और प्रगति को विनियमित करते हैं और सीआरसी 3,6,7,8 वाले रोगियों में पूर्वानुमान की भविष्यवाणी करते हैं। इस प्रकार, सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस को बाधित करने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए सीएएफ से संबंधित कारकों का शोषण किया जा सकता है। हालांकि, मेटास्टैटिक ट्यूमर स्ट्रोमा का अध्ययन करने के लिए संतोषजनक माउस मॉडल की कमी स्ट्रोमा-लक्षित उपचार विकसित करने के लिए एक बड़ी बाधा रही है।
वर्तमान में, सीआरसी लिवर मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल में प्राथमिक सीआरसी मॉडल शामिल हैं जो अनायास यकृत मेटास्टेसिस और कैंसर सेल प्रत्यारोपण मॉडल को जिगर में विकसित करते हैं। प्राथमिक सीआरसी माउस मॉडल, जैसे आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल और कैंसर कोशिकाओं के कोलोनिक इंजेक्शन, शायद ही कभी जिगरको मेटास्टेसिस दिखाते हैं 9,10,11,12। इसके अलावा, यहां तक कि अगर एक जिगर मेटास्टेसिस मनाया जाता है, तो ये मॉडल प्राथमिक ट्यूमर प्रेरण से मेटास्टेसिस तक लंबी विलंबता दिखाते हैं, और संभावित रूप से प्राथमिक ट्यूमर के बोझ से मर जातेहैं। कुशलतापूर्वक सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस उत्पन्न करने के लिए, सुसंस्कृत सीआरसी कोशिकाओं को तीन इंजेक्शन दृष्टिकोणों का उपयोग करके जिगर में प्रत्यारोपित किया जाता है: इंट्रा-स्प्लेनिक इंजेक्शन, जिगर में प्रत्यक्ष इंट्रा-पैरेन्काइमल इंजेक्शन, और पोर्टल शिरा इंजेक्शन। इंट्रा-स्प्लेनिक रूप से इंजेक्ट की गई कैंसर कोशिकाएं प्लीहा नस, पोर्टल नस, और अंततः जिगर13,14 में फैल जाती हैं। हालांकि, इंट्रा-स्प्लेनिक इंजेक्शन अन्य प्रत्यारोपण मॉडल15,16 की तुलना में कम ट्यूमर लेने का अनुपात पैदा करता है। इंट्रा-स्प्लेनिक इंजेक्शन के साथ, प्लीहा के सर्जिकल हटाने को प्लीहा में कैंसर के विकास से बचने के लिए किया जाता है, जो संभावित रूप से प्रतिरक्षा कोशिका परिपक्वता से समझौता कर सकताहै 17। इसके अलावा, इंट्रा-स्प्लेनिक इंजेक्शन के परिणामस्वरूप प्लीहा और उदर गुहा18 में अनपेक्षित ट्यूमर की वृद्धि भी हो सकती है, जो यकृत मेटास्टेसिस विश्लेषण को जटिल बनाती है। जिगर में प्रत्यक्ष इंट्रा-पैरेन्काइमल इंजेक्शन कुशलतापूर्वक यकृत मेटास्टेसिस 16,19,20 को प्रेरित करता है। फिर भी, यह दृष्टिकोण पूरी तरह से यकृत मेटास्टेसिस के जैविक चरण को दोहराता नहीं है जो स्वाभाविक रूप से पोर्टल शिरा प्रसार के माध्यम से होता है। जिगर में सीधे इंजेक्शन का उपयोग करना, एक गैर-पोर्टल में कैंसर कोशिकाओं का प्रवेश, लेकिन प्रणालीगत परिसंचरण के परिणामस्वरूप कई बड़े फेफड़ों के मेटास्टेसिस भी हो सकतेहैं। हालांकि सीआरसी लिवर मेटास्टेसिस वाले अधिकांश रोगी जिगर21 में कई ट्यूमर नोड्यूल दिखाते हैं, एक विशिष्ट यकृत लोब में प्रत्यक्ष इंजेक्शन एक एकल ट्यूमर द्रव्यमान19,20 उत्पन्न करता है। पोर्टल शिरा इंजेक्शन या mesenteric शिरा इंजेक्शन, हालांकि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण, जिगर में ट्यूमर कोशिकाओं के कुशल वितरण की अनुमति देता है एक तरह से है कि रोगियों में देखा विकास पैटर्न recapitulates17. यह रणनीति माध्यमिक-साइट मेटास्टेसिस की संभावना को कम कर सकती है और जिगर में कैंसर कोशिकाओं के तेजी से विकास को सक्षम बनाती है, जिससे माउस अस्तित्व विश्लेषण को सरल बनाया जा सकता है।
ऐतिहासिक रूप से, कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों जैसे माउस एमसी -38, मानव एचटी -29, और एसडब्ल्यू -620 का उपयोग यकृत मेटास्टेसिस22,23 के माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए किया गया था। हालांकि, ये कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनें एक डेस्मोप्लास्टिक स्ट्रोमल प्रतिक्रिया को प्रेरित नहीं करती हैं। ट्यूमर में कम स्ट्रोमल सामग्री कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट की जैविक भूमिकाओं की जांच करना मुश्किल बनाती है। सीआरसी ऑर्गेनोइड्स और उनके प्रत्यारोपण में हाल की प्रगति ने कैंसर की प्रगतिमें स्ट्रोमा की महत्वपूर्ण भूमिकाओं का आकलन करने के लिए उपयोगी प्लेटफार्मों की पेशकश की है। सीआरसी ऑर्गेनोइड्स का यकृत प्रत्यारोपण एक फाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट उत्पन्न करता है और स्ट्रोमल अनुसंधान 6,25 में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। वर्तमान में, ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल या मेसेन्टेरिक शिरा इंजेक्शन सीआरसी यकृत मेटास्टेसिस 6,25,26,27,28 उत्पन्न करने के लिए एक स्वर्ण मानक दृष्टिकोण बन गया है। फिर भी, हमारे ज्ञान के लिए, किसी भी पिछले कागजात ने कोलोरेक्टल ट्यूमरोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन के लिए विस्तृत तरीकों का वर्णन नहीं किया है। यहां, हम उपन्यास एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) -मध्यस्थता स्ट्रोमा-निर्देशित चिकित्सा विकसित करने के लिए सीआरसी ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन का उपयोग करने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करते हैं।
हेपेटोसाइट्स यकृत में मेटास्टैटिक ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का एक महत्वपूर्ण घटक है और मेटास्टैटिक कैंसर की प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाताहै। गैर-नियोप्लास्टिक रोगियों30,31 में हेपेटोसाइट्स में प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए एएवी जीन थेरेपी दृष्टिकोण की सफलता से प्रेरित होकर, हमने एक समान दृष्टिकोण की जांच की, लेकिन सीआरसी25 में यकृत ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को संशोधित करने का उद्देश्य। इस प्रकार, हम यकृत ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को संशोधित करने के लिए एंटी-ट्यूमरजेनिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए एएवी 8 के पूंछ शिरा इंजेक्शन का भी वर्णन करते हैं। AAV8 serotype, वायरस उत्पादन के दौरान वायरल capsid प्रोटीन की पसंद द्वारा नामित, हेपेटोसाइट्स की विशेष रूप से उच्च transduction दक्षता की ओर जाता है (यानी, जिगर ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में लक्षित जीन अभिव्यक्ति)32. हमने पहले दिखाया है कि Islr (इम्युनोग्लोबुलिन superfamily जिसमें ल्यूसीन-समृद्ध दोहराव होता है) एक सीएएफ-विशिष्ट जीन है जो हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) सिग्नलिंग को प्रेरित करता है, सीआरसी ट्यूमरोइड विकास को कम करता है, और Lgr5 + आंतों के स्टेम सेल भेदभाव को बढ़ावा देताहै। हमने परीक्षण किया कि क्या एएवी 8-हेपेटोसाइट्स में कैंसर-निरोधक स्ट्रोमल जीन, इसएलआर के मध्यस्थता ओवरएक्सप्रेशन, एएवी 8-इस्लर-उपचारित चूहों में सीआरसी ट्यूमरोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन का प्रदर्शन करके यकृत मेटास्टेसिस प्रगति को क्षीण कर सकता है।
इस पेपर में, हम पहले जिगर उष्णकटिबंधीय एएवी की पूंछ शिरा इंजेक्शन प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। फिर, हम एएवी-उपचारित चूहों में ट्यूमरॉइड सेल तैयारी और पोर्टल शिरा इंजेक्शन के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। अंत में, हम स्ट्रोमा-निर्देशित चिकित्सीय की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए मेटास्टैटिक ट्यूमर प्रगति की निगरानी करने के लिए दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हमने दिखाया है कि माउस सीआरसी ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल शिरा इंजेक्शन को फिर से विकसित किया जाता है जो फाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध यकृत मेटास्टेसिस उत्पन्न करता है जो मानव सीआरसी यकृत मेटास्टेस…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (APP1156391 से D.L.W., S.L.W.) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। (APP1081852 करने के लिए D.L.W., APP1140236 S.L.W., APP1099283 करने के लिए D.L.W.,); कैंसर काउंसिल एसए बीट कैंसर परियोजना अपने दाताओं और स्वास्थ्य विभाग के माध्यम से दक्षिण ऑस्ट्रेलिया की राज्य सरकार की ओर से (MCF0418 S.L.W., D.L.W.) के माध्यम से; जापान के शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय द्वारा कमीशन किए गए वैज्ञानिक अनुसंधान (बी) (20H03467 से एमटी) के लिए अनुदान-इन-एड; AMED-CREST (चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए जापान एजेंसी, विकास विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए कोर अनुसंधान (19gm0810007h0104 और 19gm1210008s0101 से A.E.); कैंसर अनुसंधान और चिकित्सीय विकास के लिए परियोजना (P-CREATE) AMED से (19cm0106332h0002 से A.E.); युवा शोधकर्ताओं के लिए विज्ञान विदेशी चुनौती कार्यक्रम के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (एच.के.), टेकेडा साइंस फाउंडेशन फैलोशिप (एच.के.), ग्रेटन इंटरनेशनल पीएचडी छात्रवृत्ति (एच.के.के.के.), लायंस मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन छात्रवृत्ति (के.जी.)।
हम वेक्टर और जीनोम इंजीनियरिंग सुविधा (वीजीईएफ), बच्चों के चिकित्सा अनुसंधान संस्थान (सीएमआरआई) (एनएसडब्ल्यू, ऑस्ट्रेलिया) में डॉ लेज़ेक लिसोव्स्की को पुनः संयोजक एएवी वैक्टर के उत्पादन के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 10% Formalin | Sigma | HT501128 | |
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 33-gauge needle | TSK | LDS-33013 | For portal vein injection |
| 4-0 vicryl suture | ETHICON | J494G | |
| 40-µm cell strainer | Corning | 431750 | |
| 5 mL Syringe | BD | 302130 | Used to apply saline to the intestine after portal vein injection |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 50 mL syringe | TERUMO | SS*50LE | Luer lock syringe for perfusion fixation |
| 70% Isopropyl alcohol wipe | Briemar | 5730 | |
| Anaesthesia machine | Darvall | 9356 | |
| αSMA antibody | DAKO | M0851 | Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry |
| Buprenorphine | TROY | N/A | ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine |
| Cotton buds | Johnson & Johnson | N/A | Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use. |
| D-luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Electric shaver | Sold by multiple suppliers | ||
| Forceps | Sold by multiple suppliers | ||
| Hamilton syringe | HAMILTON | 81020 | For portal vein injection |
| Heat box (animal warming chamber) | Datesand | MK3 | |
| Heat lamp | Sold by multiple suppliers | ||
| Hemostatic sponge | Pfizer | 09-0891-04-015 | Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm |
| India ink | Talens | 44727000 | |
| Injection syringe and needle | BD | 326769 | For tail vein injection |
| Islr probe (RNAscope) | ACD | 450041 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3244 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software | Perkin Elmer | 128113 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| MRI fibrosis tool | N/A | N/A | https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| RNAscope kit | ACD | 322300 | |
| Rodent restrainer | Sold by multiple suppliers | ||
| Rosa26-Cas9 mouse | The Jackson Laboratory | 024858 | |
| Saline | Pfizer | PHA19042010 | |
| Scissors | Sold by multiple suppliers | ||
| Skin staplers | Able Scientific | AS59028 | 9 mm wound clips |
| Stapler applicator | Able Scientific | AS59026 | 9 mm wound clip applicator |
| Stapler remover | Able Scientific | AS59037 | Wound clip remover |
| Surgical drape | Multigate | 29-220 | |
| Surgical gauze | Sentry Medical | GS001 | |
| Topical anesthesia cream | EMLA | N/A | EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | Recombinant cell-dissociation enzyme mix |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
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