在这里,描述了CRISPR干扰(CRISPRI)对 瘦身 物种中特定基因沉默的应用。 瘦素 细胞通过与表达 dCas9(催化”死亡”Cas9) 的质粒结合而发生转化,以及单导RNA (sgRNA),负责与所需的基因组目标进行碱基配对。提出了验证基因沉默的方法。
瘦身症是一种全球被忽视的动物病,每年至少造成100万例病例和近6万例死亡。这种疾病是由利普托斯皮拉属的致病性和毒性细菌引起的,要么直接接触细菌,要么间接接触受污染的水或土壤。家畜和野生动物充当感染的蓄水池宿主,通过尿液将肾脏的殖民肾管中的瘦子脱落到环境中。瘦肉精突变菌株的产生对于评估和理解感染的致病机制至关重要。CRISPR干扰(CRISPRi)已被证明是一个简单,负担得起的,和特定的工具,基因沉默在致病性瘦素。因此,将描述获得含有 dCas9 和引导 RNA 的质粒构造、通过与大肠杆菌菌株 α2163 结合将质粒输送到瘦素的方法细节,以及转造恢复和评估。此外,最近描述的霍恩斯比-阿尔特-纳利(HAN)介质允许相对快速地隔离和选择阿加板块上的突变菌落。
瘦素螺旋体病是由莱普托斯皮拉属的致病性和毒性物种引起的被忽视的全球性动物病。在人类中,这种疾病占全球每年100多万例病例和6万例死亡。到目前为止,还没有针对这种疾病的长期和有效的疫苗。确定毒性因素和致病机制对于制定更好的治疗和预防策略至关重要。因此,产生基因突变和评估结果表型的能力对功能基因组分析至关重要。
迄今为止,一直认为在致病性 瘦 肉细胞中构建突变体本身效率低下、费力、成本高昂且难以实施。随着最近CRISPR干扰(CRISPRI)应用于沙可预防4 和致病性5 瘦素,这种情况发生了巨大变化。
基因沉默是通过两个组件的表达实现的: CRISPR/Cas 的变体(c光泽regularly interspaced short p阿林德罗米奇repeat /CRISPR作为社交) en 来自链球菌皮质的Cas9酶,称为催化死亡Cas9(dCas9)和单导RNA(sgRNA),可以根据所需的目标6,7,8进行编辑。dCas9蛋白,当与sgRNA结合时,由沃森和克里克碱基配对定向到特定的DNA靶点,导致RNA聚合酶拉长的模具阻塞,导致基因沉默,由于受阻的基因转录7(图1)。
这份手稿旨在描述质粒的构造,用于表达dCas9和sgRNA,捐赠者 大肠杆菌 β2163和接受者 Leptospira 细胞之间的结合,变异体恢复,最后验证选定的突变菌落。
在对病原体15、16、17、18和沙氏19种瘦素进行早期测序后,基因组数据挖掘揭示了瘦素发病机制的几个方面。在大多数情况下,蛋白质功能是利用假定表面暴露蛋白的重组对应物和随后对原生蛋白质功能20 、 21 、 22 、 23 、 24 、 25 、 26的推测来探索的。
突变体的生成和各自表型的评价是功能基因组分析的关键组成部分。最初尝试在Leptospira spp.中产生突变体是通过随机突变体27,28,29,30实现的:然而,经过广泛和艰苦的分析,推断被破坏的基因的身份,它注意到,只有15%的所有基因在L.审讯者血清瓦马尼拉被中断27。目标基因敲除是进一步实现同源重组利用自杀质粒提供抗生素耐药性盒式侧翼同源武器在所需的目标31,32。
通过应用这些技术,探索了瘦素基础生物学和毒性的几个方面,分别探索了31、33、34、35、36、37。大肠杆菌–瘦素结合梭载体pMaOri 11的研制,使表皮基因沉默的成分得以传递。
先前已经表明,Cas9诱导的双链断裂对Leptospira spp.是致命的,作为替代,酶的催化不活性变异dCas9可用于在沙普罗菲和致病物种4,5中实现基因沉默。通过使用质粒 pMaOri.dCas9 作为 sgRNA 盒式结结的骨干,可以由于 dCas9 和 sgRNA 的表达而获得特定和稳定的基因沉默:dCas9 绑定 sgRNA 将引导蛋白质通过沃森 – 克里克碱基配对达到预期目标。
对于完整的基因沉默,原空间器应根据所需基因的模板链进行设计,以便 sgRNA 的基础配对与编码链发生。根据 Leptospira spp. 中 35% 的平均 C+G 含量,PAM 5′-NGG-3′ 将至少每 100 bp 发生 3 次。因此, 在瘦子皮拉 的基因组中,几乎任何基因都将包含至少一个PAM。但是,如果找不到主题 NGG,则可以评估替代的 NAG 主题。
以前的基因沉默技术,如锌手指和TALE(转录活化剂样的效应器),依赖于每个目标的一种不同的蛋白质的构建,使这些技术费力和昂贵的38。在CRISPRi的情况下,可变组件是sgRNA,因此只需要在5’末端更改20个基点。不仅在Leptospira第4、5页,而且在其他细菌8,39,40,41中观察到了完整、稳定和有针对性的基因沉默。
HAN介质13的发展有利于突变体的恢复,通过大幅缩短细胞群形成的孵化时间,并允许Leptospira在37°C生长。 然而,在结合过程中,不建议使用大肠杆菌,因为大肠杆菌可以在此介质中大力增殖,并克服供体细胞和受体细胞之间的预定1:1比例。在这个阶段,EMJH 加 DAP 是更好的选择,因为大肠杆菌在这个媒体中复制不良。值得一提的是,一些实验室内部补充了EMJH,其中可以包含额外的组件,可能也支持大肠杆菌细胞的生长。
这里提出的结合协议是优化为 L.审讯 塞罗瓦尔哥本哈根尼菌株Fiocruz L1-130,它也被证明是有效的转化最近分离的致病菌株从土壤样本5。最初尝试与 L.博格佩特塞尼 物种的不同血清,表明较低的结合效率与上述协议。因此,在与 Leptospira的不同物种/细胞人合作时,应根据供体:受体细胞比例、初始细胞密度、结合介质和时间(24和48小时)以经验方式确定构思的最佳条件。有理由假设不同的 利普托斯皮拉 物种和血清动物的行为会因不同的结合协议而不同。
尽管沙普罗皮 拉 菌落在板块上相对容易想象,但致病菌落可能更难观察。通常,通过使用 HAN 介质补充 0.4% 兔血清和光谱霉素,可以在第 10 天观察到变异菌落。根据我们的经验,殖民地最初是媒体表面的透明光环。在视频协议中,密集的殖民地,经过14天的生长,显示,因为透明的很难拍摄。在这个阶段,旋转板块以实现不同的光发生率,并在白色和黑暗背景之间移动,可以帮助识别殖民地。
对于突变验证,免疫印迹提供了一种简单明了的方法:然而,由于抗体并不总是针对目标蛋白质可用,可以采取替代策略来验证基因沉默。使用目标基因引数的定量反转录酶 PCR (qRT-PCR) 和构成控制可以有效地验证基因沉默,因为 sgRNA 引导的 dCas9 负责基因转录的阻塞。如果目标基因编码蛋白质凝胶中明确定义的蛋白质带,SDS-PAGE可以证明沉默,并根据 lipL32基因沉默5。如果 LPS 生物合成基因被静音,可以使用 LPS 染色:在沉默基因编码与定义明确的基质的酶的情况下,动能测定与染色基质是有效的策略:L. biflexa 的β-伽拉西达斯沉默通过使用 X-gal 和 ONPG(正交-硝基-β-加拉克托赛德)基材4来验证。
在确认基因沉默后,可以设计实验来进一步评估表型。在沉默细菌粘合剂的情况下,可以进行绑定分析;血清挑战分析证实了利加和利格B在致病性瘦素5所表现的血清存活中的作用。突变体还可用于给动物接种疫苗,以评估毒性的衰减:在这种情况下,与突变体接种的动物应与仅含有 pMaOri.dCas9 的细胞感染者进行比较。
最后,目前的协议描述了CRISPR在致病性 瘦肉 精物种中应用CRISPR基因沉默,使用HAN介质促进突变恢复在10天内。基因沉默与功能基因组分析相结合,将增进我们对 瘦素致病机制的理解,并最终导致制定更好的疾病控制预防策略。
The authors have nothing to disclose.
美国农业部是一个机会均等的提供者和雇主。本出版物中提及商号或商业产品只是为了提供具体信息,并不意味着美国农业部的建议或认可。巴西FAPESP机构(赠款2014/50981-0)在财政上支持这项工作;LGVF 由 FAPESP (2017/06731-8 和 2019/20302-8) 提供研究金资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿编写方面没有作用。作者还感谢美国农业部视觉服务部的汉娜·希尔和亚历山大·格里姆斯拍摄和编辑视频协议。
0.1 µm pore size mixed cellulose esters membrane | Millipore | VCWP02500 | Filtration for bacterial conjugation |
2,6-Diaminopimelic acid (DAP) | Sigma | D1377 | Growth of auxotrophic E. coli β2163 |
Agar Noble | BD & Company | 214230 | Used for preparation of solid EMJH and HAN plates |
Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Used for preparation of solid LB plates |
Clarity Western ECL substrate | Biorad | 170-5060 | Chemiluminescent substrate |
dNTP set | Thermo Fisher | 10297-018 | dNTPs for PCR reaction |
Glass Microanalysis Filter Holder | Millipore | XX1012530 | Filtration for bacterial conjugation |
Imaging System | Biorad | ChemiDoc MP | Chemiluminescence detection |
LB broth, Miller | BD & Company | 244620 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
Leptospira Enrichment EMJH | BD & Company | 279510 | Supplementation of EMJH media |
Leptospira Medium Base EMJH | BD & Company | 279410 | EMJH medium for Leptospira |
Mini-PROTEAN TGX Gels 12% | Biorad | 4568043 | Used for polyacrylamide gel eletrophoresis |
Optical density reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | For optical density measurements of bacterial cultures |
Phosphate Buffered Saline 7.4 | Sigma | 806552 | Saline solution for washing bacterial pellets |
Spectinomycin | Sigma | S0692 | Selection of pMaOri backbone plasmids |
Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher | EP0402 | Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction |
Thermocycler | Applied Biosystem | GeneAmp PCR System 9700 | Used for PCR reaction cycling |
Thymidine (dT) | Sigma | T9250 | Growth of auxotrophic E. coli π1 |
XmaI restriction enzyme | New Englan BioLabs | R0180L | Digestion of plasmids and inserts |