Hier wird die Anwendung der CRISPR-Interferenz (CRISPRi) für spezifisches Gen-Silencing bei Leptospira-Spezies beschrieben. Leptospira-Zellen werden durch Konjugation mit Plasmiden transformiert, die dCas9 (katalytisch “totes” Cas9) und eine Single-Guide-RNA (sgRNA) exprimieren, die für die Basenpaarung zum gewünschten genomischen Ziel verantwortlich ist. Methoden zur Validierung des Gen-Silencing werden vorgestellt.
Leptospirose ist eine weltweit vernachlässigte Zoonose, die für mindestens 1 Million Fälle pro Jahr und fast 60.000 Todesfälle verantwortlich ist. Die Krankheit wird durch pathogene und virulente Bakterien der Gattung Leptospiraverursacht, entweder durch direkten Kontakt mit den Bakterien oder indirekt durch Exposition gegenüber kontaminiertem Wasser oder Boden. Haus- und Wildtiere fungieren als Reservoirwirte der Infektion und scheiden Leptospiren aus kolonisierten Nierentubuli der Niere über Urin in die Umwelt aus. Die Erzeugung mutierter Stämme von Leptospira ist entscheidend, um pathogene Infektionsmechanismen zu bewerten und zu verstehen. CRISPR-Interferenz (CRISPRi) hat sich als einfaches, erschwingliches und spezifisches Werkzeug für das Gen-Silencing in pathogenen Leptospiraerwiesen. Daher werden die methodischen Details zur Gewinnung der Plasmidkonstrukte, die sowohl dCas9 als auch Leit-RNA enthalten, zur Abgabe von Plasmiden an Leptospira durch Konjugation mit dem E. coli-Stamm β2163 und zur transkonjuganten Erholung und Bewertung beschrieben. Darüber hinaus ermöglichen die kürzlich beschriebenen Hornsby-Alt-Nally (HAN) Medien die relativ schnelle Isolierung und Selektion von mutierten Kolonien auf Agarplatten.
Leptospirose ist eine weltweit vernachlässigte Zoonose, die durch pathogene und virulente Arten der Gattung Leptospiraverursacht wird. Beim Menschen ist die Krankheit für mehr als eine Million Fälle und 60.000 Todesfälle pro Jahr weltweitverantwortlich 1,2. Bisher gibt es keinen langfristigen und wirksamen Impfstoff gegen die Krankheit. Die Identifizierung von Virulenzfaktoren und pathogenen Mechanismen ist entscheidend für die Entwicklung besserer therapeutischer und prophylaktischer Strategien. Daher ist die Fähigkeit, genetische Mutationen zu erzeugen und den resultierenden Phänotyp zu bewerten, entscheidend für die funktionelle Genomanalyse3.
Der Aufbau von Mutanten in pathogenem Leptospira galt bisher als von Natur aus ineffizient, mühsam, kostspielig und schwer umzusetzen. Dieses Szenario änderte sich drastisch mit der Anwendung der jüngsten CRISPR-Interferenz (CRISPRi) auf saprophytische4 und pathogene5 Leptospiren.
Gen-Silencing wird durch die Expression von zwei Komponenten erreicht: einer Variante des CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated) Enzym Cas9 aus Streptococcus pyogenes,katalytisch totes Cas9 (dCas9) genannt und einer Single-Guide-RNA (sgRNA), die nach dem gewünschten Target editiert werden kann6,7,8. dCas9-Protein, wenn es an die sgRNA gebunden ist, wird durch Watson- und Crick-Basenpaarung auf spezifische DNA-Ziele gerichtet, was zu einer sterischen Blockade der RNA-Polymerase-Elongation führt, was zu einer Genstummung aufgrund der blockierten Gentranskription führt7 (Abbildung 1).
Dieses Manuskript zielt darauf ab, die Konstruktion des Plasmids für die Exprimation von dCas9 und sgRNA, die Konjugation zwischen Spender E. coli β2163 und Empfänger-Leptospira-Zellen, die transkonjugante Erholung und schließlich die Validierung ausgewählter Mutantenkolonien zu beschreiben.
Nach der frühen Sequenzierung der pathogenen15,16,17,18 und saprophytischen19 Leptospira-Arten beleuchtete das Data Mining des Genoms verschiedene Aspekte der leptospiralen Pathogenese. In den meisten Fällen wurde die Proteinfunktion unter Verwendung des rekombinanten Gegenstücks von mutmaßlichen leptospiralen oberflächenexponierten Proteinen und anschließender Spekulation der nativen Proteinfunktion20,21,22,23,24,25,26untersucht.
Die Erzeugung von Mutanten und die Bewertung ihres jeweiligen Phänotyps sind Schlüsselkomponenten der funktionellen Genomanalyse. Erste Versuche, Mutanten in Leptospira spp. zu erzeugen, wurden durch zufällige Transposonmutagenese27,28,29,30erreicht; Nach umfangreicher und mühsamer Analyse zur Ableitung der Identität gestörter Gene wurde jedoch festgestellt, dass nur 15% aller Gene in L. interrogans serovar Manilae gestört waren27. Der gezielte Gen-Knockout wurde weiter durch homologe Rekombination unter Verwendung von Selbstmordplasmiden erreicht, um eine Antibiotikaresistenzkassette zu liefern, die von homologen Armen innerhalb des gewünschten Ziels flankiert wird31,32.
Durch die Anwendung dieser Technologien wurden mehrere Aspekte der leptospiralen Grundlagenbiologie und Virulenz untersucht31,33,34,35,36,37. Die Entwicklung des E. coli–Leptospira konjugativen Shuttle-Vektors, pMaOri 11, ermöglichte die Abgabe von Komponenten für das episomale Gen-Silencing.
Es wurde bereits gezeigt, dass der Cas9-induzierte Doppelstrangbruch für Leptospira spp. tödlich ist und alternativ die katalytisch inaktive Variante des Enzyms, dCas9, verwendet werden kann, um Gen-Silencing sowohl bei saprophytischen als auch bei pathogenen Spezies4,5zu erreichen. Durch die Verwendung des Plasmids pMaOri.dCas9 als Rückgrat für die sgRNA-Kassettenligatur kann aufgrund der Expression von dCas9 und sgRNA ein spezifisches und stabiles Gen-Silencing erzielt werden; dCas9-gebundene sgRNA führt das Protein durch Watson-Crick-Basenpaarung zum gewünschten Ziel.
Für ein vollständiges Gen-Silencing sollte der Protospacer basierend auf dem Vorlagenstrang des gewünschten Gens so konzipiert werden, dass die Basenpaarung der sgRNA mit dem kodierenden Strang erfolgt. Basierend auf einem durchschnittlichen C+G-Gehalt von 35% in Leptospira spp. tritt das PAM 5′-NGG-3′ mindestens 3 mal alle 100 bp auf. Daher wird praktisch jedes Gen im Genom von Leptospira mindestens ein PAM enthalten. Wird das Motiv NGG jedoch nicht gefunden, kann das alternative NAG-Motiv bewertet werden.
Frühere Gen-Silencing-Techniken wie Zinkfinger und TALE (Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektoren) beruhten auf der Konstruktion eines anderen Proteins für jedes Ziel, was diese Techniken mühsam und kostspielig machte38. Im Falle von CRISPRi ist die variable Komponente die sgRNA, so dass nur die 20 bp am 5′-Ende geändert werden müssen. Vollständiges, stabiles und gezieltes Gen-Silencing wurde nicht nur bei Leptospira spp.4,5, sondern auch bei anderen Bakterien8,39,40,41beobachtet.
Die Entwicklung von HAN media13 begünstigte die Erholung von Mutanten, indem die Inkubationszeit für die Koloniebildung drastisch verkürzt wurde und Leptospira bei 37 oC wachsen kann. Während des Konjugationsschritts wird seine Verwendung jedoch nicht empfohlen, da sich E. coli in diesem Medium stark vermehren und das beabsichtigte 1:1-Verhältnis zwischen Spender- und Empfängerzellen überwinden kann. In diesem Stadium ist EMJH plus DAP die bessere Wahl, da sich E. coli in diesem Medium schlecht replizieren. Es ist erwähnenswert, dass einige Labore intern ergänztes EMJH herstellen, das zusätzliche Komponenten enthalten kann, die auch das Wachstum von E. coli-Zellen unterstützen könnten.
Das hier vorgestellte Konjugationsprotokoll wurde für den L. interrogans serovar Copenhageni Stamm Fiocruz L1-130 optimiert und erwies sich auch bei der Umwandlung eines kürzlich isolierten pathogenen Stammes aus Bodenproben als wirksam5. Erste Versuche mit verschiedenen Serovaren von L. borgpetersenii-Arten deuten auf geringere Konjugationseffizienzen mit dem beschriebenen Protokoll hin. Daher sollten bei der Arbeit mit verschiedenen Spezies/Serovaren von Leptospiradie optimalen Bedingungen für die Konjugation empirisch unter Berücksichtigung der Spender-Empfängerzell-Proportionen, der anfänglichen Zelldichten, der Konjugationsmedien und der Zeit (24 und 48 h) bestimmt werden. Es ist vernünftig anzunehmen, dass sich verschiedene Leptospira-Arten und Serovare mit unterschiedlichen Konjugationsprotokollen unterschiedlich verhalten.
Obwohl saprophytische Leptospira-Kolonien auf Platten relativ einfach zu visualisieren sind, können pathogene Kolonien schwieriger zu beobachten sein. Normalerweise können durch die Verwendung von HAN-Medien, die mit 0,4% Kaninchenserum und Spectinomycin ergänzt werden, transkonjugante Kolonien am Tag 10 beobachtet werden. Unserer Erfahrung nach präsentieren sich Kolonien zunächst als transparenter Halo an der Medienoberfläche. Im Videoprotokoll werden dichtere Kolonien nach 14 Tagen Wachstum gezeigt, da die transparenten schwer zu filmen waren. In diesem Stadium kann das Drehen der Platte, um einen unterschiedlichen Lichteinfall zu erzielen, und das Wechseln zwischen weißem und dunklem Hintergrund helfen, Kolonien zu identifizieren.
Für die Mutantenvalidierung bietet Immunoblotting einen einfachen Ansatz; Da jedoch nicht immer Antikörper gegen Zielproteine zur Verfügung stehen, können alternative Strategien zur Validierung des Gen-Silencing verfolgt werden. Quantitative Reverse-Transkriptase-PCR (qRT-PCR) unter Verwendung von Primern für das Zielgen und einer konstitutiven Kontrolle ist wirksam, um genstummen zu validieren, da sgRNA-gesteuertes dCas9 für die Blockierung der Gentranskription verantwortlich ist. Wenn das Zielgen für ein klar definiertes Proteinband in Proteingelen kodiert, kann SDS-PAGE Silencing und gemäß dem lipL32 Gen Silencing5nachweisen. Wenn LPS-Biosynthesegene zum Schweigen gebracht werden, kann LPS-Färbung eingesetzt werden; im Falle der Stummschaltung von Genen, die für Enzyme mit genau definierten Substraten kodieren, sind kinetische Assays mit chromogenen Substraten gültige Strategien; β-Galactosidase-Schalldämpfen in L. biflexa wurde durch die Verwendung von X-gal- und ONPG-Substraten (Ortho-Nitrophenyl-β-Galactosid) validiert4.
Nach Bestätigung des Gen-Silencing können Experimente zur weiteren Bewertung des Phänotyps konzipiert werden. Bindungsassays können im Falle der Stummschaltung bakterieller Adhäsine durchgeführt werden; Serum-Challenge-Assays bestätigten die Rolle von LigA und LigB beim Serumüberleben, die durch das pathogene Leptospira5gezeigt wurde. Mutanten können auch verwendet werden, um Tiere zu impfen, um die Dämpfung der Virulenz zu beurteilen; In diesem Fall sollten Tiere, die mit der Mutante geimpft wurden, nur mit Solchen verglichen werden, die mit Zellen infiziert sind, die pMaOri.dCas9 enthalten.
Zusammenfassend beschreibt das aktuelle Protokoll die Anwendung von CRISPRi für das Gen-Silencing bei pathogenen Leptospira-Spezies unter Verwendung von HAN-Medien, um die Mutantenerholung innerhalb von 10 Tagen zu erleichtern. Gen-Silencing in Kombination mit funktioneller genomischer Analyse wird unser Verständnis der pathogenen Mechanismen von Leptospiraverbessern und letztendlich zur Entwicklung besserer prophylaktischer Strategien zur Krankheitskontrolle führen.
The authors have nothing to disclose.
USDA ist ein Anbieter und Arbeitgeber für Chancengleichheit. Die Erwähnung von Handelsnamen oder Handelsprodukten in dieser Veröffentlichung dient ausschließlich der Bereitstellung spezifischer Informationen und impliziert keine Empfehlung oder Billigung durch das US-Landwirtschaftsministerium. Die brasilianische Agentur FAPESP (Grant 2014/50981-0) unterstützte diese Arbeit finanziell; LGVF wird mit einem Stipendium der FAPESP (2017/06731-8 und 2019/20302-8) gefördert. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Manuskriptvorbereitung. Die Autoren danken auch Hannah Hill und Alexander Grimes von den USDA Visual Services für das Filmen und Bearbeiten des Videoprotokolls.
0.1 µm pore size mixed cellulose esters membrane | Millipore | VCWP02500 | Filtration for bacterial conjugation |
2,6-Diaminopimelic acid (DAP) | Sigma | D1377 | Growth of auxotrophic E. coli β2163 |
Agar Noble | BD & Company | 214230 | Used for preparation of solid EMJH and HAN plates |
Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Used for preparation of solid LB plates |
Clarity Western ECL substrate | Biorad | 170-5060 | Chemiluminescent substrate |
dNTP set | Thermo Fisher | 10297-018 | dNTPs for PCR reaction |
Glass Microanalysis Filter Holder | Millipore | XX1012530 | Filtration for bacterial conjugation |
Imaging System | Biorad | ChemiDoc MP | Chemiluminescence detection |
LB broth, Miller | BD & Company | 244620 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
Leptospira Enrichment EMJH | BD & Company | 279510 | Supplementation of EMJH media |
Leptospira Medium Base EMJH | BD & Company | 279410 | EMJH medium for Leptospira |
Mini-PROTEAN TGX Gels 12% | Biorad | 4568043 | Used for polyacrylamide gel eletrophoresis |
Optical density reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | For optical density measurements of bacterial cultures |
Phosphate Buffered Saline 7.4 | Sigma | 806552 | Saline solution for washing bacterial pellets |
Spectinomycin | Sigma | S0692 | Selection of pMaOri backbone plasmids |
Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher | EP0402 | Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction |
Thermocycler | Applied Biosystem | GeneAmp PCR System 9700 | Used for PCR reaction cycling |
Thymidine (dT) | Sigma | T9250 | Growth of auxotrophic E. coli π1 |
XmaI restriction enzyme | New Englan BioLabs | R0180L | Digestion of plasmids and inserts |