यहां लेप्टोस्पायरा प्रजातियों में विशिष्ट जीन सिलने के लिए CRISPR हस्तक्षेप (CRISPRi) के आवेदन का वर्णन किया गया है । लेप्टोस्पायरा कोशिकाओं को dCas9 (उत्प्रेरक रूप से “मृत” Cas9) और एक एकल-गाइड आरएनए (sgRNA) व्यक्त करने वाले प्लाज्मिड्स के साथ संवत् द्वारा परिवर्तित किया जाता है, जो वांछित जीनोमिक लक्ष्य के आधार बांधना के लिए जिम्मेदार होता है। जीन को मान्य करने के तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं।
लेप्टोस्पाइरोसिस एक वैश्विक उपेक्षित ज़ूनोसिस है, जो प्रति वर्ष कम से कम 1 मिलियन मामलों और लगभग 60 हजार मौतों के लिए जिम्मेदार है। यह रोग लेप्टोस्पायराजीनस के रोगजनक और उग्र बैक्टीरिया के कारण होता है, या तो बैक्टीरिया के साथ सीधे संपर्क से या अप्रत्यक्ष रूप से दूषित पानी या मिट्टी के संपर्क में। घरेलू और जंगली जानवर संक्रमण के जलाशय मेजबान के रूप में कार्य करते हैं, मूत्र के माध्यम से, मूत्र के माध्यम से, पर्यावरण में गुर्दे के उपनिवेश गुर्दे के ट्यूबल से लेप्टोस्पायर बहाते हैं। संक्रमण के रोगजनक तंत्र का मूल्यांकन और समझने के लिए लेप्टोस्पायरा के उत्परिवर्ती उपभेदों की पीढ़ी महत्वपूर्ण है। CRISPR हस्तक्षेप (CRISPRi) रोगजनक लेप्टोस्पायरामें जीन मुंह के लिए एक सीधा, सस्ती और विशिष्ट उपकरण साबित हुआ है। इसलिए, प्लाज्मिड दोनों dCas9 और गाइड आरएनए, ई कोलाई तनाव के साथ conjugation द्वारा लेप्टोस्पिरा के लिए प्लाज्मिड की डिलीवरी, और ट्रांसकोजुगंत वसूली और मूल्यांकन, दोनों युक्त निर्माण प्राप्त करने के पद्धतिगत विवरण का वर्णन किया जाएगा। इसके अलावा, हाल ही में वर्णित Hornsby-Alt-Nally (हान) मीडिया अपेक्षाकृत तेजी से अलगाव और आगर प्लेटों पर उत्परिवर्ती कालोनियों के चयन के लिए अनुमति देता है ।
लेप्टोस्पाइरा एक उपेक्षित दुनिया भर में ज़ूनोसिस है जो लेप्टोस्पाइराजीनस की रोगजनक और उग्र प्रजातियों के कारण होता है। मनुष्यों में, यह बीमारी दुनिया भर में 1,2मिलियन से अधिक मामलों और प्रति वर्ष 60,000 मौतोंकेलिए है। अभी तक इस बीमारी का दीर्घकालिक और कारगर टीका नहीं है। उग्रता कारकों और रोगजनक तंत्र की पहचान बेहतर चिकित्सीय और रोगनिरोधी रणनीतियों के विकास के लिए निर्णायक है। इसलिए, आनुवंशिक उत्परिवर्तन उत्पन्न करने और परिणामस्वरूप फेनोटाइप का आकलन करने की क्षमता कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण3के लिए महत्वपूर्ण है।
रोगजनक लेप्टोस्पायरा में म्यूटेंट के निर्माण पर विचार किया गया था, अब तक, स्वाभाविक रूप से अक्षम, श्रमसाध्य, महंगा और लागू करना मुश्किल था। यह परिदृश्य हाल ही में CRISPR हस्तक्षेप (CRISPRi) के आवेदन के साथ सैप्रोफाइटिक4 और रोगजनक5 लेप्टोस्पायर में काफी बदल गया।
जीन मुंह से दो घटकों की अभिव्यक्ति द्वारा प्राप्त किया जाता है: CRISPR/Cas का एकसंस्करण(सीचमकदार आरएगुलरली मैंnterspaced short palindromic repeat/सी RISPR के रूप मेंमिलनसार) एंजाइम एंजाइम स्ट्रेप्टोकोकस पायोजीन सेCas9, जिसे उत्प्रेरक रूप से मृत Cas9 (dCas9) और एक एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) कहा जाता है, जिसे वांछित लक्ष्य6,7,8के अनुसार संपादित किया जा सकता है। dCas9 प्रोटीन, जब sgRNA के लिए बाध्य, वाटसन और क्रिकेटरों आधार बांधना द्वारा विशिष्ट डीएनए लक्ष्यों के लिए निर्देशित किया है, आरएनए बहुलक विस्तार के लिए एक स्टेरिक रुकावट के कारण, बाधित जीन प्रतिलेखन7 (चित्रा 1)के कारण जीन मुंह में जिसके परिणामस्वरूप ।
इस पांडुलिपि का उद्देश्य dCas9 और sgRNA दोनों को व्यक्त करने के लिए प्लाज्मिड के निर्माण का वर्णन करना है, दाता ई. कोलाई 2163 और प्राप्तकर्ता लेप्टोस्पिरा कोशिकाओं, ट्रांसकोन्जुगंत रिकवरी और अंत में, चयनित उत्परिवर्ती उपनिवेशों के सत्यापन के बीच संजीता।
रोगजनक15, 16, 17, 18और सैप्रोफाइटिक19 लेप्टोस्पेरा प्रजातियों के प्रारंभिक अनुक्रमण के बाद, जीनोम के डेटा खनन ने लेप्टोस्पाइरल रोगजनकों के कई पहलुओं पर प्रकाश डाला। ज्यादातर मामलों में, ख्यात लेप्टोस्पाइरल सतह से उजागर प्रोटीन के पुनर्संयोजन समकक्ष और उसके बाद देशी प्रोटीन समारोह20, 21, 22, 23,24,25,25,26के पुनर्संयोजन समकक्ष का उपयोग करके प्रोटीन समारोह का पतालगायागया था।
म्यूटेंट की पीढ़ी, और उनके संबंधित फेनोटाइप का मूल्यांकन, कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के प्रमुख घटक हैं। लेप्टोस्पिरा एसपीपी में म्यूटेंट उत्पन्न करने के प्रारंभिक प्रयास यादृच्छिक ट्रांसपोसनम्यूटेनेसिस27,28, 29,30द्वारा प्राप्तकिएगए थे। हालांकि, बाधित जीन की पहचान का अनुमान लगाने के लिए व्यापक और श्रमसाध्य विश्लेषण के बाद, यह नोट किया गया कि एल इंटररोजन सेरोवर मनीला में सभी जीनों में से केवल 15%27बाधित थे । लक्षित जीन नॉकआउट को31,32के भीतर समरूप हथियारों से घिरे एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट देने के लिए आत्मघाती प्लाज्मिड्स का उपयोग करते हुए रीकॉम्बेशन द्वारा और अधिक हासिल किया गया था ।
इन प्रौद्योगिकियों को लागू करके, लेप्टोस्पायरल बेसिक बायोलॉजी और उग्रता के कई पहलुओं का पता लगाया गया31,33,34,35, 36,37. ई. कोलाईके विकास –लेप्टोस्पाइरा कंजूगेटिव शटल वेक्टर, pMaOri 11,एपिसोमल जीन साइलेंसिंग के लिए घटकों के वितरण की अनुमति दी।
यह पहले दिखाया गया था कि Cas9-प्रेरित डबल-स्ट्रैंड ब्रेक लेप्टोस्पायरा एसपीपी के लिए घातक है। और, एक विकल्प के रूप में, एंजाइम के उत्प्रेरक निष्क्रिय संस्करण, dCas9, दोनों सप्रोफिटिक और रोगजनक प्रजातियों4, 5में जीन मुंह को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। sgRNA कैसेट लिगेशन के लिए एक रीढ़ के रूप में प्लाज्मिड pMaOri.dCas9 का उपयोग करके, dCas9 और sgRNA दोनों की अभिव्यक्ति के कारण विशिष्ट और स्थिर जीन चुप्पी प्राप्त की जा सकती है; dCas9-बाउंड sgRNA वाटसन-क्रिक बेस पेयरिंग द्वारा वांछित लक्ष्य के लिए प्रोटीन का नेतृत्व करेंगे ।
पूर्ण जीन मुंह के लिए, प्रोटोस्पेसर वांछित जीन के टेम्पलेट स्ट्रैंड के आधार पर डिजाइन किया जाना चाहिए ताकि sgRNA की आधार बांधना कोडिंग स्ट्रैंड के साथ होता है । लेप्टोस्पिरा एसपीपी में 35% की औसत सी + जी सामग्री के आधार पर, पीएपी 5′-एनजीजी-3′ हर 100 बीपी में कम से कम 3 गुना हो जाएगा। इसलिए, लेप्टोस्पायरा के जीनोम के भीतर लगभग किसी भी जीन में कम से कम एक पाम शामिल होगा। हालांकि, यदि आदर्श एनजीजी नहीं मिला है, तो वैकल्पिक नाग आकृति का मूल्यांकन किया जा सकता है।
पिछले जीन चुप्पी तकनीकों, जैसे जस्ता उंगलियों और कहानी (प्रतिलेखन सक्रियक की तरह प्रभावक), प्रत्येक लक्ष्य के लिए एक अलग प्रोटीन के निर्माण पर भरोसा किया, इन तकनीकों श्रमसाध्य और महंगा३८बना । CRISPRi के मामले में, वेरिएबल कंपोनेंट sgRNA है, जिससे केवल 5 ‘ अंत में 20 बीपी को बदलना आवश्यक हो जाता है । पूर्ण, स्थिर और लक्षित जीन मुंह से न केवल लेप्टोस्पायरा एसपीपी में देखा गया है।4,5,बल्कि अन्य बैक्टीरिया8,39,40, 41में भी।
हान मीडिया13 के विकास ने कॉलोनी गठन के लिए इनक्यूबेशन समय को काफी कम करके म्यूटेंट की वसूली का पक्ष लिया और लेप्टोस्पायरा को 37 ओसी में बढ़ने की अनुमति दी। हालांकि, संयुग्मण चरण के दौरान, इसके उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि ई. कोलाई इस मीडिया में तेजी से पैदा हो सकता है और दाता और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के बीच इच्छित 1:1 अनुपात को दूर कर सकता है। इस स्तर पर, EMJH प्लस डीएपी बेहतर विकल्प है, क्योंकि ई. कोलाई इस मीडिया में खराब दोहराने । यह उल्लेखनीय है कि कुछ प्रयोगशालाएं इन-हाउस पूरक ईएमजेएच बनाती हैं, जिसमें अतिरिक्त घटक हो सकते हैं जो ई कोलाई कोशिकाओं के विकास का भी समर्थन कर सकते हैं।
यहां प्रस्तुत संयुग्म प्रोटोकॉल एल इंटररोगेन्स सेरोवर कोपेनहेगनी तनाव फियोक्रूज़ एल 1-130 के लिए अनुकूलित किया गया था, और यह मिट्टी के नमूनों से हाल ही में अलग रोगजनक तनाव के परिवर्तन में प्रभावी साबित भी हुआ था5। एल बोर्गपेटेरसेनी प्रजातियों के विभिन्न सेवरों के साथ प्रारंभिक प्रयास वर्णित प्रोटोकॉल के साथ कम संयुग्म क्षमता का संकेत देते हैं। इस प्रकार, लेप्टोस्पाइराकी विभिन्न प्रजातियों/सेवरों के साथ काम करते समय, संयुग्मण के लिए इष्टतम स्थितियों को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए, दाता पर विचार करते हुए: प्राप्तकर्ता सेल अनुपात, प्रारंभिक सेल घनत्व, संयुग्मण मीडिया और समय (24 और 48 घंटे) । यह मानना उचित है कि विभिन्न लेप्टोस्पेरा प्रजातियां और सेवर अलग-अलग संजीदगी प्रोटोकॉल के साथ अलग-अलग व्यवहार करेंगे।
भले ही सैप्रोफाइटिक लेप्टोस्पेरा उपनिवेश प्लेटों पर कल्पना करना अपेक्षाकृत आसान है, रोगजनक उपनिवेशों का निरीक्षण करना अधिक कठिन हो सकता है। आम तौर पर, 0.4% खरगोश सीरम और स्पेक्टिनोमाइसिन के साथ पूरक हान मीडिया का उपयोग करके, ट्रांसकोजुगंत कॉलोनियों को 10 दिन में देखा जा सकता है। हमारे अनुभव में, उपनिवेशों शुरू में मीडिया की सतह पर एक पारदर्शी प्रभामंडल के रूप में मौजूद हैं । वीडियो प्रोटोकॉल में डेंजर कॉलोनियों को 14 दिन की ग्रोथ के बाद दिखाया गया है, क्योंकि पारदर्शी लोगों को फिल्म करना मुश्किल था। इस स्तर पर, विभिन्न प्रकाश घटनाओं को प्राप्त करने और सफेद और अंधेरे पृष्ठभूमि के बीच स्थानांतरण करने के लिए प्लेट घुमाने से उपनिवेशों की पहचान करने में मदद मिल सकती है।
उत्परिवर्ती सत्यापन के लिए, इम्यूनोब्लोटिंग एक सीधा दृष्टिकोण प्रदान करता है; हालांकि, चूंकि एंटीबॉडी हमेशा लक्षित प्रोटीन के खिलाफ उपलब्ध नहीं होते हैं, इसलिए जीन को मान्य करने के लिए वैकल्पिक रणनीतियों को आगे बढ़ाया जा सकता है। लक्ष्य जीन के लिए प्राइमर का उपयोग करके मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्टेस पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) और जीन को मान्य करने के लिए एक संविलियन नियंत्रण प्रभावी है क्योंकि जीन ट्रांसक्रिप्शन की रुकावट के लिए एसजीआरएनए-निर्देशित dCas9 जिम्मेदार है। यदि लक्ष्य जीन प्रोटीन जैल में एक स्पष्ट रूप से परिभाषित प्रोटीन बैंड एन्कोड करता है, तो एसडीएस-पेज मुंह को प्रदर्शित कर सकता है, और लिपल32 जीन के अनुसार5। यदि एलपीएस बायोसिंथेसिस जीन को खामोश कर दिया जाता है, तो एलपीएस धुंधला को नियोजित किया जा सकता है; अच्छी तरह से परिभाषित सब्सट्रेट्स वाले एंजाइमों के लिए जीन एन्कोडिंग को मुंह में रखने के मामले में, क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट्स के साथ गतिज परख वैध रणनीतियां हैं; एल बिफ्लेक्सा में β-गैलेक्टोसिडेस साइलेंस को एक्स-गल और ओएनजीजी (ऑर्थो-नाइट्रोफेनिल-β-गैलेक्टोसाइड) सब्सट्रेट्स4के उपयोग से मान्य किया गया था।
जीन साइलेंसिंग की पुष्टि के बाद, प्रयोगों को फेनोटाइप का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। बैक्टीरियल आसंजन को मुंह में बंद करने के मामले में बाध्यकारी परख की जा सकती है; सीरम-चैलेंज परख ने रोगजनक लेप्टोस्पायरा 5द्वारा प्रदर्शित सीरम सर्वाइवल में लिगा और एलआईजीबी की भूमिका की पुष्टि की । म्यूटेंट का उपयोग जानवरों को उग्रता के क्षीण होने का आकलन करने के लिए टीका लगाने के लिए भी किया जा सकता है; इस मामले में, उत्परिवर्ती के साथ टीका लगाने वाले जानवरों की तुलना केवल pMaOri.dCas9 युक्त कोशिकाओं से संक्रमित लोगों से की जानी चाहिए।
अंत में, वर्तमान प्रोटोकॉल 10 दिनों के भीतर उत्परिवर्ती वसूली की सुविधा के लिए हान मीडिया का उपयोग कर रोगजनक लेप्टोस्पेरा प्रजातियों में जीन मुंह के लिए CRISPRi के आवेदन का वर्णन करता है । कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के साथ संयुक्त जीन चुप्पी लेप्टोस्पायराके रोगजनक तंत्र की हमारी समझ में सुधार करेगी, और अंततः रोग नियंत्रण के लिए बेहतर रोगनिरोधी रणनीतियों के विकास के लिए अग्रणी होगी।
The authors have nothing to disclose.
यूएसडीए एक समान अवसर प्रदाता और नियोक्ता है। इस प्रकाशन में व्यापार नाम या वाणिज्यिक उत्पादों का उल्लेख केवल विशिष्ट जानकारी प्रदान करने के उद्देश्य के लिए है, और अमेरिकी कृषि विभाग द्वारा सिफारिश या समर्थन का मतलब नहीं है । ब्राजील की एजेंसी FAPESP (अनुदान 2014/50981-0) आर्थिक रूप से इस काम का समर्थन किया; एलजीवीएफ को FAPESP (2017/06731-8 और 2019/20302-8) से फैलोशिप के साथ वित्त पोषित किया जाता है । अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि तैयार करने में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी। लेखकों को भी फिल्माने और वीडियो प्रोटोकॉल संपादन के लिए USDA दृश्य सेवाओं से हंना हिल और अलेक्जेंडर ग्रिम्स का शुक्रिया अदा करते हैं ।
0.1 µm pore size mixed cellulose esters membrane | Millipore | VCWP02500 | Filtration for bacterial conjugation |
2,6-Diaminopimelic acid (DAP) | Sigma | D1377 | Growth of auxotrophic E. coli β2163 |
Agar Noble | BD & Company | 214230 | Used for preparation of solid EMJH and HAN plates |
Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Used for preparation of solid LB plates |
Clarity Western ECL substrate | Biorad | 170-5060 | Chemiluminescent substrate |
dNTP set | Thermo Fisher | 10297-018 | dNTPs for PCR reaction |
Glass Microanalysis Filter Holder | Millipore | XX1012530 | Filtration for bacterial conjugation |
Imaging System | Biorad | ChemiDoc MP | Chemiluminescence detection |
LB broth, Miller | BD & Company | 244620 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
Leptospira Enrichment EMJH | BD & Company | 279510 | Supplementation of EMJH media |
Leptospira Medium Base EMJH | BD & Company | 279410 | EMJH medium for Leptospira |
Mini-PROTEAN TGX Gels 12% | Biorad | 4568043 | Used for polyacrylamide gel eletrophoresis |
Optical density reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | For optical density measurements of bacterial cultures |
Phosphate Buffered Saline 7.4 | Sigma | 806552 | Saline solution for washing bacterial pellets |
Spectinomycin | Sigma | S0692 | Selection of pMaOri backbone plasmids |
Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher | EP0402 | Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction |
Thermocycler | Applied Biosystem | GeneAmp PCR System 9700 | Used for PCR reaction cycling |
Thymidine (dT) | Sigma | T9250 | Growth of auxotrophic E. coli π1 |
XmaI restriction enzyme | New Englan BioLabs | R0180L | Digestion of plasmids and inserts |