ここで、 レプトスピラ 種における特異的遺伝子サイレンシングに対するCRISPR干渉(CRISPRi)の適用について説明する。 レプトスピラ 細胞は、dCas9(触媒的に「死んだ」Cas9)とシングルガイドRNA(sgRNA)を発現するプラスミドとの共役によって形質転換され、所望のゲノム標的への塩基対合を担う。遺伝子サイレンシングを検証する方法を紹介します。
レプトスピラ症は世界的に放置された動物性感染症であり、年間少なくとも100万例、約6万人の死亡を引き起こしています。この疾患は、レプトスピラ属の病原性および有害な細菌によって引き起こされるもので、細菌と直接接触するか、汚染された水または土壌への暴露によって間接的に起こされる。家畜および野生動物は感染の貯蔵所として機能し、腎臓の植民地化された腎尿細管から尿を介して環境にレプトスピレスを流す。レプトスピラの変異株の生成は、感染の病原性メカニズムを評価し、理解するために重要です。CRISPR干渉(CRISPRi)は、病原性レプトスピラにおける遺伝子サイレンシングのための簡単で手頃な価格で特定のツールであることが証明されています。したがって、dCas9とガイドRNAの両方を含むプラスミド構築物を得る方法論的詳細、大腸菌株β2163との共役によるレプトスピラへのプラスミドの送達、およびトランスコンジュガント回収および評価、について説明する。さらに、最近説明されたHornsby-Alt-Nally(HAN)培地は、寒天プレート上の突然変異コロニーの比較的迅速な単離および選択を可能にする。
レプトスピラ症は、レプトスピラ属の病原性および毒性の種によって引き起こされる無視された世界的な動物性である。ヒトでは、この病気は世界中で年間100万人以上の症例と60,000人の死亡を占めています。これまでのところ、この病気に対する長期的かつ効果的なワクチンはありません。病原性因子および病原性メカニズムの同定は、より良い治療および予防戦略の開発にとって極めて重要である。したがって、遺伝子変異を生成し、得られた表現型を評価する能力は、機能的ゲノム解析3にとって極めて重要である。
病原性 レプトスピラ における変異体の構築は、これまで、本質的に非効率的で、骨が折れ、高価で、実装が困難であると考えられていました。このシナリオは、最近のCRISPR干渉(CRISPRi)を窒息4 および病原性5 レプトスピレスに適用して大きく変化しました。
遺伝子サイレンシングは、CRISPR/Casの変種(c光沢のあるregularly interspaced s hortpalindromic repeat/CRISPRの2つの成分の発現によって達成される )酵素Cas9は、連鎖死Cas9(dCas9)およびシングルガイドRNA(sgRNA)と呼ばれる、所望の標的6、7、8に従って編集することができる。dCas9タンパク質は、sgRNAに結合すると、ワトソンとクリック塩基対合により特異的なDNA標的に向けられ、RNAポリメラーゼ伸長に対して立体的閉塞を引き起こし、遺伝子転写7の閉塞による遺伝子サイレンシングを生じる(図1)。
本稿は、dCas9およびsgRNAの両方を発現するためのプラスミドの構築、ドナー 大腸菌 β2163およびレシピエント レプトスピラ 細胞との間の結合、経協同化、および最後に、選択された突然変異コロニーの検証を記述することを目的とする。
病原性15、16、17、18種の早期シーケンシングおよび天下19種の細胞化後、レプトスパイラル病因のいくつかの側面にゲノムのデータマイニングが光を当てた。ほとんどの場合、タンパク質機能は、遺伝子組換えのレプトスパイラル表面露出タンパク質と、その後のネイティブタンパク質機能20、21、22、23、24、25、26の組換え対応を用いて探索した。
変異体の生成、およびそれぞれの表現型の評価は、機能的ゲノム解析の主要な構成要素である。レプトスピラsppで変異体を生成する最初の試みは、ランダムトランスポゾン突然変異誘発27、28、29、30によって達成された。しかし、破壊された遺伝子の同一性を推測するための広範かつ骨の折れる分析の後、L. インターロガン・セロバー・マニラの全遺伝子の15%だけが27を破壊した。標的遺伝子ノックアウトは、自殺プラスミドを利用した相同組換えによってさらに達成され、目的の標的31,32内に相同の腕で横たわる抗生物質耐性カセットを送達する。
これらの技術を応用することにより、レプトスパイラル基礎生物学と病原性のいくつかの側面を探索した31、33、34、35 、36、37.大腸菌–レプトスピラ共役シャトルベクターの開発により、pMaOri 11は、エピソーム遺伝子サイレンシング用の成分の送達を可能にした。
Cas9誘導二本鎖破断はレプトスピラspp.に対して致死的であり、代わりに触媒的に不活性な酵素の変異体dCas9は、生理学的および病原性種4、5の両方で遺伝子サイレンシングを達成するために使用できることが示された。プラスミドpMaOri.dCas9をsgRNAカセットライゲーションのバックボーンとして使用することにより、dCas9とsgRNAの両方の発現により特異的かつ安定的な遺伝子サイレンシングが得られる。dCas9結合sgRNAは、ワトソン-クリック塩基対合により、所望の標的にタンパク質を導く。
完全な遺伝子サイレンシングのために、プロトスペースサーは、sgRNAの塩基対がコード鎖と共に起こるように、所望の遺伝子のテンプレート鎖に基づいて設計されるべきである。 レプトスピラ spp.の平均C+G含有量35%に基づいて、PAM 5′-NGG-3’は100 bpごとに少なくとも3回発生します。したがって、 レプトスピラ のゲノム内の事実上すべての遺伝子には、少なくとも1つのPAMが含まれます。しかし、モチーフNGGが見つからない場合、代替NAGモチーフを評価することができます。
以前の遺伝子サイレンシング技術は、ジンクフィンガーおよびTALE(転写活性化剤様エフェクター)のような、各標的に対して1つの異なるタンパク質の構築に依存し、これらの技術を骨の折れる、高価な38にする。CRISPRiの場合、可変成分はsgRNAであり、5’の終わりで20 bpだけを変更する必要があります。完全、安定、および標的遺伝子サイレンシングは、レプトスピラspp. 4,5だけでなく、他の細菌でも観察されている8,39,40,41.
HAN培地13の開発は、コロニー形成のためのインキュベーション時間を大幅に短縮し、レプトスピラが37o Cで成長することを可能にすることによって突然変異体の回復を支持した。しかし、共役工程中は、大腸菌がこの培地で激しく増殖し、ドナー細胞とレシピエント細胞の間で意図された1:1の割合を克服できるため、その使用はお勧めできません。この段階では、大腸菌はこのメディアで不十分に複製されるため、EMJHプラスDAPが良い選択です。一部の研究所は、大腸菌細胞の増殖をサポートする可能性のある追加のコンポーネントを含むことができる社内補足EMJHを作ることは言及する価値があります。
ここで提示される共役プロトコルは 、L.インターロガンス セロバルコペンハーゲン株フィオクルスL1-130に最適化され、また、土壌サンプル5から最近単離された病原性株の形質転換に有効であることが証明された。 L.ボルグペテルセニ 種の異なる血清バールを持つ最初の試みは、記載されたプロトコルとのより低い共役効率を示す。したがって、 レプトスピラの異なる種/血清体を扱う場合、結合のための最適な条件は、ドナー:レシピエント細胞の割合、初期細胞密度、共役培地および時間(24および48時間)を考慮して、経験的に決定されるべきである。レ プトスピラ 種とセロバルは、異なる共役プロトコルで異なる動作をすると仮定するのが妥当です。
窒息 性レプトスピラ コロニーはプレート上で比較的容易に視覚化できますが、病原性コロニーの観察はより困難です。通常、0.4%のウサギ血清およびスペチノマイシンを補ったHAN培地を用いることによって、トランスコンジュガントコロニーは10日目に観察され得る。私たちの経験では、コロニーは最初にメディア表面に透明なハローとして存在します。ビデオプロトコルでは、より密度の高いコロニーが、14日間の成長後、透明なものがフィルム化しにくいために示されている。この段階では、プレートを回転して異なる光発生率を達成し、白と暗い背景の間をシフトすると、コロニーを特定するのに役立ちます。
変異型の検証のために、イムノブロッティングは簡単なアプローチを提供します。しかし、抗体は標的タンパク質に対して常に利用できるとは限らないので、遺伝子サイレンシングを検証する代替戦略を追求することができます。sgRNA誘導dCas9は遺伝子転写の閉塞を担うため、標的遺伝子および構成制御にプライマーを用いた定量的な逆転写酵素PCR(qRT-PCR)は、遺伝子サイレンシングの検証に有効である。標的遺伝子がタンパク質ゲル中に明確に定義されたタンパク質バンドをコードする場合、SDS-PAGEはサイレンシングを実証することができ、またlipL32遺伝子に従ってサイレンシング5。LPS生合成遺伝子が沈黙している場合、LPS染色を採用することができます。明確に定義された基質を持つ酵素をコードする遺伝子をサイレンシングする場合、発火基質を用いた運動アッセイは有効な戦略である。β-ビフレクサにおけるβ-ガラクトシダーゼサイレンシングは、X-galおよびONPG(オルト・ニトロフェニル-βガラクトシド)基質4の使用により検証された。
遺伝子サイレンシングの確認後、さらに表現型を評価する実験を設計することができる。結合アッセイは、細菌の接着をサイレンシングする場合に行うことができる。血清チャレンジアッセイは、病原性 レプトスピラ5によって表示される血清生存におけるLigAおよびLigBの役割を確認した。変異体はまた、毒性の減衰を評価するために動物を接種するために使用することができます。この場合、変異体を接種した動物は、pMaOri.dCas9のみを含む細胞に感染したものと比較されるべきである。
結論として、現在のプロトコルは、10日以内に変異回復を促進するためにHAN培地を使用して病原性 レプトスピラ 種における遺伝子サイレンシングのためのCRISPRiの適用を記述する。遺伝子サイレンシングと機能ゲノム解析を組み合わせることで、 レプトスピラの病原性メカニズムの理解が深まり、最終的には疾病管理のためのより良い予防戦略の開発につながります。
The authors have nothing to disclose.
USDAは機会均等プロバイダーと雇用主です。本書に記載されている商号や商用製品の言及は、特定の情報を提供する目的のみを目的としており、米国農務省の推薦または承認を意味するものではありません。ブラジルの機関FAPESP(助成金2014/50981-0)は、この作業を財政的に支援しました。LGVFはFAPESP(2017/06731-8および2019/20302-8)からのフェローシップで資金提供されています。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に何の役割も持っていませんでした。著者らはまた、ビデオプロトコルを撮影し、編集するためのUSDAビジュアルサービスのハンナ・ヒルとアレクサンダー・グライムズに感謝します。
0.1 µm pore size mixed cellulose esters membrane | Millipore | VCWP02500 | Filtration for bacterial conjugation |
2,6-Diaminopimelic acid (DAP) | Sigma | D1377 | Growth of auxotrophic E. coli β2163 |
Agar Noble | BD & Company | 214230 | Used for preparation of solid EMJH and HAN plates |
Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Used for preparation of solid LB plates |
Clarity Western ECL substrate | Biorad | 170-5060 | Chemiluminescent substrate |
dNTP set | Thermo Fisher | 10297-018 | dNTPs for PCR reaction |
Glass Microanalysis Filter Holder | Millipore | XX1012530 | Filtration for bacterial conjugation |
Imaging System | Biorad | ChemiDoc MP | Chemiluminescence detection |
LB broth, Miller | BD & Company | 244620 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
Leptospira Enrichment EMJH | BD & Company | 279510 | Supplementation of EMJH media |
Leptospira Medium Base EMJH | BD & Company | 279410 | EMJH medium for Leptospira |
Mini-PROTEAN TGX Gels 12% | Biorad | 4568043 | Used for polyacrylamide gel eletrophoresis |
Optical density reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | For optical density measurements of bacterial cultures |
Phosphate Buffered Saline 7.4 | Sigma | 806552 | Saline solution for washing bacterial pellets |
Spectinomycin | Sigma | S0692 | Selection of pMaOri backbone plasmids |
Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher | EP0402 | Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction |
Thermocycler | Applied Biosystem | GeneAmp PCR System 9700 | Used for PCR reaction cycling |
Thymidine (dT) | Sigma | T9250 | Growth of auxotrophic E. coli π1 |
XmaI restriction enzyme | New Englan BioLabs | R0180L | Digestion of plasmids and inserts |