Aqui, é descrita a aplicação da interferência CRISPR (CRISPRi) para silenciamento genético específico em espécies de Leptospira. As células leptospira são transformadas pela conjugação com plasmídeos expressando dCas9 (catalyticamente “morto” Cas9) e um RNA de guia único (sgRNA), responsável pelo emparelhamento base ao alvo genômico desejado. São apresentados métodos para validar o silenciamento genético.
A leptospirose é uma zoonose negligenciada global, responsável por pelo menos 1 milhão de casos por ano e quase 60 mil mortes. A doença é causada por bactérias patogênicas e virulentas do gênero Leptospira,seja pelo contato direto com a bactéria ou indiretamente pela exposição à água ou ao solo contaminados. Animais domésticos e silvestres atuam como hospedeiros de infecção, derramando leptospirais de túbulos renais colonizados do rim, via urina, para o meio ambiente. A geração de cepas mutantes de Leptospira é fundamental para avaliar e entender mecanismos patogênicos de infecção. A interferência CRISPR (CRISPRi) provou ser uma ferramenta simples, acessível e específica para o silenciamento genético em Leptospirapatogênico . Portanto, serão descritos os detalhes metodológicos da obtenção dos construtos plasmídeos contendo dCas9 e guia do RNA, a entrega de plasmídeos ao Leptospira por conjugação com a cepa E. coli β2163, e recuperação e avaliação transconjugut. Além disso, a mídia recentemente descrita de Hornsby-Alt-Nally (HAN) permite o isolamento relativamente rápido e a seleção de colônias mutantes em placas de ágar.
Leptospirose é uma zoonose mundial negligenciada causada por espécies patogênicas e virulentas do gênero Leptospira. Em humanos, a doença é responsável por mais de um milhão de casos e 60.000 mortes por ano em todo o mundo1,2. Até agora, não há vacina de longo prazo e eficaz para a doença. A identificação de fatores de virulência e mecanismos patogênicos é fundamental para o desenvolvimento de melhores estratégias terapêuticas e profiláticas. Portanto, a capacidade de gerar mutações genéticas e avaliar o fenótipo resultante é fundamental para a análise genômica funcional3.
A construção de mutantes em Leptospira patogênico foi considerada, até agora, inerentemente ineficiente, laboriosa, cara e difícil de implementar. Este cenário mudou drasticamente com a aplicação da recente interferência CRISPR (CRISPRi) para leptospires saprofíticos4 epatogênicos 5.
O silenciamento genético é alcançado pela expressão de dois componentes: uma variante da enzima CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR comoenciaado) Cas9 de Streptococcus pyogenes, chamado cas9 (dCas9) e um RNA de guia único (sgRNA), que pode ser editado de acordo com o alvo desejado6,7,8. a proteína dCas9, quando vinculada ao sgRNA, é direcionada a alvos específicos de DNA por Watson e Crick, causando um bloqueio estérico ao alongamento da polimerase RNA, resultando em silenciamento genético devido à transcrição genética obstruída7 (Figura 1).
Este manuscrito tem como objetivo descrever a construção do plasmídeo para expressar tanto dCas9 quanto sgRNA, conjugação entre o doador E. coli β2163 e células leptospiras receptoras, recuperação transconjugulante e, finalmente, validação de colônias mutantes selecionadas.
Após o sequenciamento precoce depatogênicos 15,16,17,18 e19espécies de Leptospira, a mineração de dados do genoma lançou luz sobre vários aspectos da patogênese leptospiral. Na maioria dos casos, a função proteica foi explorada utilizando-se a contrapartida recombinante de proteínas leptospirais putativas expostas à superfície e posterior especulação da função proteica nativa20,21,22,23,24,25,26.
A geração de mutantes, e a avaliação de seus respectivos fenótipos, são componentes-chave da análise genômica funcional. As tentativas iniciais de gerar mutantes em Leptospira spp. foram alcançadas por mutagênese transposon aleatória27,28,29,30; no entanto, após análises extensas e trabalhosas para inferir a identidade dos genes rompidos, observou-se que apenas 15% de todos os genes em L. interrogans serovar Manilae foram interrompidos27. O nocaute genético direcionado foi ainda mais alcançado pela recombinação homólogoa utilizando plasmídeos suicidas para entregar um de resistência a antibióticos ladeado por braços homólogos dentro do alvo desejado31,32.
Aplicando essas tecnologias, foram explorados diversos aspectos da biologia básica leptospiral e virulência31,33,34,35,36,37. O desenvolvimento do vetor de transporte conjugal E. coli–Leptospira, pMaOri 11, permitiu a entrega de componentes para silenciamento genético epissomal.
Foi demonstrado anteriormente que a quebra de dois fios induzidos por Cas9 é letal para Leptospira spp. e, como alternativa, a variante catalyticamente inativa da enzima, dCas9, pode ser usada para alcançar o silenciamento genético nas espécies saprofísticas e patogênicas4,5. Usando o plasmid pMaOri.dCas9 como espinha dorsal para ligante de sgRNA, o silenciamento genético específico e estável pode ser obtido devido à expressão de dCas9 e sgRNA; o sgRNA vinculado a dCas9 levará a proteína ao alvo desejado pelo emparelhamento de base Watson-Crick.
Para o silenciamento genético completo, o protoespaço deve ser projetado com base no fio de modelo do gene desejado para que o emparelhamento base do sgRNA ocorra com o fio de codificação. Com base em um teor médio de C+G de 35% em Leptospira spp., o PAM 5′-NGG-3′ ocorrerá pelo menos 3 vezes a cada 100 bp. Portanto, praticamente qualquer gene dentro do genoma de Leptospira conterá pelo menos um PAM. No entanto, se o motivo NGG não for encontrado, o motivo alternativo do NAG pode ser avaliado.
Técnicas anteriores de silenciamento genético, como dedos de zinco e TALE (efeitos semelhantes ao ativador de transcrição), contavam com a construção de uma proteína diferente para cada alvo, tornando essas técnicas laboriosas e caras38. No caso do CRISPRi, o componente variável é o sgRNA, tornando necessário apenas alterar os 20 bp no final de 5′. O silenciamento genético completo, estável e direcionado tem sido observado não apenas em Leptospira spp.4,5, mas também em outras bactérias8,39,40,41.
O desenvolvimento da mídia HAN13 favoreceu a recuperação dos mutantes, reduzindo drasticamente o tempo de incubação para a formação de colônias e permitindo que Leptospira crescesse a 37 oC. No entanto, durante a etapa de conjugação, seu uso não é recomendado, uma vez que o E. coli pode proliferar vigorosamente nesta mídia e superar a proporção pretendida de 1:1 entre células doadoras e receptoras. Nesta fase, a EMJH plus DAP é a melhor escolha, já que e. coli se replica mal nesta mídia. Vale ressaltar que alguns laboratórios fazem emjh suplementado internamente, que pode conter componentes adicionais que também podem suportar o crescimento de células E. coli.
O protocolo de conjugação aqui apresentado foi otimizado para l. interrogans serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130, e também foi comprovado ser eficaz na transformação de uma cepa patogênica recentemente isolada a partir de amostras de solo5. Tentativas iniciais com diferentes serovars de espécies L. borgpetersenii indicam menor eficiência conjugal com o protocolo descrito. Assim, ao trabalhar com diferentes espécies/serovares de Leptospira,as condições ideais para a conjugação devem ser determinadas empiricamente, considerando as proporções de células receptoras, densidades celulares iniciais, mídia de conjugação e tempo (24 e 48 h). É razoável supor que diferentes espécies de Leptospira e serovars se comportarão de forma diferente com diferentes protocolos de conjugação.
Embora as colônias de Leptospira saprofíticas sejam relativamente fáceis de visualizar em placas, colônias patogênicas podem ser mais difíceis de observar. Normalmente, usando mídia HAN suplementada com soro de coelho e espectina de coelho de 0,4% e espectinomicina, colônias transconjugut podem ser observadas no dia 10. Em nossa experiência, colônias inicialmente presentes como um halo transparente na superfície da mídia. No protocolo de vídeo, colônias mais densas, após 14 dias de crescimento, são mostradas já que as transparentes eram difíceis de filmar. Nesta fase, girar a placa para obter diferentes incidência de luz e deslocar entre fundos brancos e escuros pode ajudar a identificar colônias.
Para validação mutante, a imunoblotting oferece uma abordagem simples; no entanto, como os anticorpos nem sempre estão disponíveis contra proteínas-alvo, estratégias alternativas para validar o silenciamento genético podem ser perseguidas. PcR de transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR) usando primers para o gene alvo e um controle constitutivo é eficaz para validar o silenciamento genético, uma vez que o dCas9 guiado pelo SGRNA é responsável pelo bloqueio da transcrição genética. Se o gene alvo codificar uma faixa proteica claramente definida em géis proteicos, o SDS-PAGE pode demonstrar silenciamento, e de acordo com o gene lipL32 silenciando5. Se os genes da biossíntese LPS forem silenciados, a coloração de LPS pode ser empregada; no caso de silenciar genes codificadores para enzimas com substratos bem definidos, ensaios cinéticos com substratos cromogênicos são estratégias válidas; β-galactosidase silenciando em L. biflexa foi validado pelo uso de substratos X-gal e ONPG (ortho-Nitrophenyl-β-galactoside)substratos 4.
Após a confirmação do silenciamento genético, os experimentos podem ser projetados para avaliar ainda mais o fenótipo. Ensaios de vinculação podem ser realizados no caso de silenciamento de adesivos bacterianos; ensaios de desafio sérico confirmaram o papel de LigA e LigB na sobrevivência do soro exibida por Leptospirapatogênico 5. Mutantes também podem ser usados para inocular animais para avaliar atenuação da virulência; neste caso, os animais inoculados com o mutante devem ser comparados com aqueles infectados apenas com células contendo pMaOri.dCas9.
Em conclusão, o protocolo atual descreve a aplicação de CRISPRi para silenciamento genético em espécies patogênicas de Leptospira usando mídia HAN para facilitar a recuperação de mutantes dentro de 10 dias. O silenciamento genético combinado com a análise genômica funcional melhorará nossa compreensão dos mecanismos patogênicos do Leptospira,e, em última instância, levará ao desenvolvimento de melhores estratégias profiláticas para o controle de doenças.
The authors have nothing to disclose.
O USDA é um provedor de igualdade de oportunidades e empregador. A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é exclusivamente com o propósito de fornecer informações específicas, e não implica recomendação ou endosso do Departamento de Agricultura dos EUA. A agência brasileira FAPESP (outorga 2014/50981-0) apoiou financeiramente esse trabalho; A LGVF é financiada com uma bolsa da FAPESP (2017/06731-8 e 2019/20302-8). Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração de manuscritos. Os autores também agradecem Hannah Hill e Alexander Grimes do USDA Visual Services por filmar e editar o protocolo de vídeo.
0.1 µm pore size mixed cellulose esters membrane | Millipore | VCWP02500 | Filtration for bacterial conjugation |
2,6-Diaminopimelic acid (DAP) | Sigma | D1377 | Growth of auxotrophic E. coli β2163 |
Agar Noble | BD & Company | 214230 | Used for preparation of solid EMJH and HAN plates |
Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Used for preparation of solid LB plates |
Clarity Western ECL substrate | Biorad | 170-5060 | Chemiluminescent substrate |
dNTP set | Thermo Fisher | 10297-018 | dNTPs for PCR reaction |
Glass Microanalysis Filter Holder | Millipore | XX1012530 | Filtration for bacterial conjugation |
Imaging System | Biorad | ChemiDoc MP | Chemiluminescence detection |
LB broth, Miller | BD & Company | 244620 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
Leptospira Enrichment EMJH | BD & Company | 279510 | Supplementation of EMJH media |
Leptospira Medium Base EMJH | BD & Company | 279410 | EMJH medium for Leptospira |
Mini-PROTEAN TGX Gels 12% | Biorad | 4568043 | Used for polyacrylamide gel eletrophoresis |
Optical density reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | For optical density measurements of bacterial cultures |
Phosphate Buffered Saline 7.4 | Sigma | 806552 | Saline solution for washing bacterial pellets |
Spectinomycin | Sigma | S0692 | Selection of pMaOri backbone plasmids |
Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher | EP0402 | Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction |
Thermocycler | Applied Biosystem | GeneAmp PCR System 9700 | Used for PCR reaction cycling |
Thymidine (dT) | Sigma | T9250 | Growth of auxotrophic E. coli π1 |
XmaI restriction enzyme | New Englan BioLabs | R0180L | Digestion of plasmids and inserts |