Здесь описано применение ИНТЕРФЕРЕНЦИИ CRISPR (CRISPRi) для специфического глушения генов у видов Leptospira. Клетки лептоспир трансформируются путем конъюгации с плазмидами, экспрессирующими dCas9 (каталитически «мертвый» Cas9) и однонаправленной РНК (sgRNA), отвечающей за спаривание оснований с желаемой геномной мишенью. Представлены методы валидации глушения генов.
Лептоспироз является глобальным забытым зоонозом, ответственным за не менее 1 миллиона случаев в год и почти 60 тысяч смертей. Заболевание вызывается патогенными и вирулентными бактериями рода Leptospira,либо при непосредственном контакте с бактериями, либо косвенно при воздействии загрязненной воды или почвы. Домашние и дикие животные действуют как резервуарные хозяева инфекции, выбрасывая лептоспиры из колонизированных почечных канальцев почки через мочу в окружающую среду. Генерация мутантных штаммов Leptospira имеет решающее значение для оценки и понимания патогенных механизмов инфекции. Интерференция CRISPR (CRISPRi) оказалась простым, доступным и специфическим инструментом для глушения генов в патогенных Leptospira. Поэтому будут описаны методологические детали получения плазмидных конструкций, содержащих как dCas9, так и направляющую РНК, доставки плазмид в Leptospira путем конъюгации со штаммом E. coli β2163, а также трансконъюгантного восстановления и оценки. Кроме того, недавно описанная среда Хорнсби-Альт-Нэлли (HAN) позволяет относительно быстро изолирует и отбирать колонии мутантов на агаровых пластинах.
Лептоспироз является запущенным во всем мире зоонозом, вызванным патогенными и вирулентными видами рода Leptospira. У людей на болезнь приходится более одного миллиона случаев заболевания и 60 000 смертей в год во всем мире1,2. До сих пор не существует долгосрочной и эффективной вакцины от болезни. Выявление факторов вирулентности и патогенных механизмов имеет решающее значение для разработки более эффективных терапевтических и профилактических стратегий. Поэтому способность генерировать генетические мутации и оценивать полученный фенотип имеет решающее значение для функционального геномного анализа3.
Конструировать мутантов в патогенных Leptospira до сих пор считалось по своей сути неэффективным, трудоемким, дорогостоящим и трудным в реализации. Этот сценарий резко изменился с применением недавней интерференции CRISPR (CRISPRi) к сапрофитным4 и патогенным5 лептоспирам.
Глушение генов достигается экспрессией двух компонентов: варианта CRISPR/Cas(cблестящего regularly interspaced short palindromic repeat/C RISPR каксоциированного) фермента Cas9 из Streptococcus pyogenes,называемого каталитически мертвым Cas9 (dCas9) и однонаправленной РНК (sgRNA), которая может быть отредактирована в соответствии с желаемой мишенью6,7,8. Белок dCas9, будучи связанным с sgRNA, направляется к специфическим мишеням ДНК путем спаривания оснований Уотсона и Крика, вызывая стерическую блокировку удлинения РНК-полимеразы, что приводит к глушению генов из-за затрудненной транскрипции гена7 (рисунок 1).
Эта рукопись направлена на описание конструкции плазмиды для экспрессии как dCas9, так и sgRNA, конъюгации между донорской E. coli β2163 и клетками-реципиентами Leptospira, трансконъюгантного восстановления и, наконец, валидации выбранных мутантных колоний.
После раннего секвенирования патогенных15,16,17,18 и сапрофитных19видовLeptospira, анализ данных генома пролил свет на несколько аспектов патогенеза лептоспиральных. В большинстве случаев функцию белка исследовали с помощью рекомбинантного аналога предполагаемого лептоспирального поверхностно-экспонированного белка и последующего предположения о нативной функции белка20,21,22,23,24,25,26.
Генерация мутантов и оценка их соответствующего фенотипа являются ключевыми компонентами функционального геномного анализа. Первоначальные попытки генерации мутантов в Leptospira spp. были достигнуты случайным транспозонным мутагенезом27,28,29,30; однако после обширного и кропотливого анализа для вывода идентичности нарушенных генов было отмечено, что только 15% всех генов у L. interrogans serovar Manilae были нарушены27. Целевой нокаут гена был дополнительно достигнут путем гомологичного рекомбинации с использованием плазмид самоубийства для доставки кассеты устойчивости к антибиотикам, окруженной гомологичными руками в пределах желаемойцели 31,32.
Применяя эти технологии, были исследованы некоторые аспекты лептоспиральной базовой биологии и вирулентности31,33,34,35,36,37. Развитие конъюгативного челночного вектора E. coli–Leptospira, pMaOri 11,позволило доставлять компоненты для эписомального глушения генов.
Ранее было показано, что cas9-индуцированный двухцепочечный разрыв смертелен для Leptospira spp. и, в качестве альтернативы, каталитически неактивный вариант фермента, dCas9, может быть использован для достижения глушения генов как у сапрофитных, так и у патогенных видов4,5. Используя плазмиду pMaOri.dCas9 в качестве основы для лигирования кассет сгРНК, можно получить специфическое и стабильное глушение генов за счет экспрессии как dCas9, так и sgRNA; dCas9-связанная sgRNA приведет белок к желаемой цели путем спаривания основания Уотсона-Крика.
Для полного глушения генов протоспейсер должен быть спроектирован на основе шаблонной цепи желаемого гена таким образом, чтобы происходит спаривание оснований sgRNA с кодирующей нитью. Исходя из среднего содержания C + G 35% в Leptospira spp., PAM 5′-NGG-3′ будет встречаться не менее 3 раз каждые 100 bp. Поэтому практически любой ген в геноме Leptospira будет содержать хотя бы один PAM. Однако, если мотив NGG не найден, альтернативный мотив NAG может быть оценен.
Предыдущие методы глушения генов, такие как цинковые пальцы и TALE (эффекторы, подобные активатору транскрипции), основывались на построении одного отдельного белка для каждой мишени, что делало эти методы трудоемкими и дорогостоящими38. В случае CRISPRi переменным компонентом является sgRNA, что делает необходимым изменение только 20 bp на 5′ конце. Полное, стабильное и целенаправленное глушение генов наблюдалось не только у Leptospira spp.4,5,но и у других бактерий8,39,40,41.
Разработка HAN media13 благоприятствовала восстановлению мутантов, резко сокращая время инкубации для формирования колоний и позволяя Leptospira расти при 37 oC. Однако на этапе конъюгации его использование не рекомендуется, поскольку кишечная палочка может энергично размножаться в этой среде и преодолевать предполагаемую пропорцию 1:1 между донорскими и реципиентными клетками. На данном этапе EMJH плюс DAP является лучшим выбором, так как E. coli плохо реплицируются в этой среде. Стоит отметить, что некоторые лаборатории производят внутри компании дополненный EMJH, который может содержать дополнительные компоненты, которые также могут поддерживать рост клеток E. coli.
Представленный здесь протокол сопряжения был оптимизирован для L. interrogans серовар копенгагенского штамма Fiocruz L1-130, а также доказано его эффективность при трансформации недавно выделенного патогенного штамма из образцов почвы5. Первоначальные попытки применения различных сероваров видов L. borgpetersenii указывают на более низкую эффективность сопряжения с описанным протоколом. Таким образом, при работе с различными видами/сероварами Leptospiraоптимальные условия конъюгации следует определять эмпирически, учитывая пропорции донора:клетки-реципиента, начальную плотность клеток, конъюгационные среды и время (24 и 48 ч). Разумно предположить, что разные виды Leptospira и серовары будут вести себя по-разному с разными протоколами сопряжения.
Несмотря на то, что сапрофитные колонии Leptospira относительно легко визуализировать на пластинах, патогенные колонии может быть труднее наблюдать. В норме при использовании среды HAN, дополненной 0,4% кроличьей сывороткой и спектиномицином, трансконъюгантные колонии могут наблюдаться на 10-й день. По нашему опыту, колонии изначально присутствуют в виде прозрачного ореола на поверхности среды. В видеопротокольном виде показаны более плотные колонии после 14 дней роста, так как прозрачные колонии было трудно снять. На этом этапе вращение пластины для достижения различного освещения и смещение между белым и темным фоном может помочь идентифицировать колонии.
Для валидации мутантов иммуноблоттинг предлагает простой подход; однако, поскольку антитела не всегда доступны против белков-мишеней, можно использовать альтернативные стратегии для проверки глушения генов. Количественная ПЦР с обратной транскриптазой (qRT-PCR) с использованием праймеров для гена-мишени и конститутивного контроля эффективна для проверки глушения генов, поскольку dCas9, управляемый сгРНК, отвечает за блокировку транскрипции генов. Если ген-мишень кодирует четко определенную белковую полосу в белковых гелях, SDS-PAGE может продемонстрировать глушение, и в соответствии с геном lipL32 глушение5. Если гены биосинтеза LPS заглушены, можно использовать окрашивание LPS; в случае глушения генов, кодирующих ферменты с четко определенными субстратами, кинетические анализы с хромогенными субстратами являются действительными стратегиями; β-галактозидазы в L. biflexa было подтверждено использованием субстратов X-gal и ONPG (орто-нитрофенил-β-галактозид)4.
После подтверждения глушения генов могут быть разработаны эксперименты для дальнейшей оценки фенотипа. Связывающие анализы могут быть выполнены в случае глушения бактериальных адгезинов; анализы сывороточного вызова подтвердили роль LigA и LigB в выживаемости сыворотки, показанной патогенными Leptospira5. Мутанты также могут быть использованы для прививки животных для оценки ослабления вирулентности; в этом случае животных, привитых мутантом, следует сравнивать с инфицированными только клетками, содержащими только pMaOri.dCas9.
В заключение, текущий протокол описывает применение CRISPRi для глушения генов у патогенных видов Leptospira с использованием среды HAN для облегчения восстановления мутантов в течение 10 дней. Глушение генов в сочетании с функциональным геномным анализом улучшит наше понимание патогенных механизмов Leptospiraи в конечном итоге приведет к разработке лучших профилактических стратегий для борьбы с болезнями.
The authors have nothing to disclose.
USDA является поставщиком равных возможностей и работодателем. Упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов в этой публикации предназначено исключительно с целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения со стороны Министерства сельского хозяйства США. Бразильское агентство FAPESP (грант 2014/50981-0) финансово поддержало эту работу; LGVF финансируется стипендией FAPESP (2017/06731-8 и 2019/20302-8). Спонсоры не имели никакого значения в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Авторы также благодарят Ханну Хилл и Александра Граймса из USDA Visual Services за съемку и редактирование видеопротоколя.
0.1 µm pore size mixed cellulose esters membrane | Millipore | VCWP02500 | Filtration for bacterial conjugation |
2,6-Diaminopimelic acid (DAP) | Sigma | D1377 | Growth of auxotrophic E. coli β2163 |
Agar Noble | BD & Company | 214230 | Used for preparation of solid EMJH and HAN plates |
Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Used for preparation of solid LB plates |
Clarity Western ECL substrate | Biorad | 170-5060 | Chemiluminescent substrate |
dNTP set | Thermo Fisher | 10297-018 | dNTPs for PCR reaction |
Glass Microanalysis Filter Holder | Millipore | XX1012530 | Filtration for bacterial conjugation |
Imaging System | Biorad | ChemiDoc MP | Chemiluminescence detection |
LB broth, Miller | BD & Company | 244620 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
Leptospira Enrichment EMJH | BD & Company | 279510 | Supplementation of EMJH media |
Leptospira Medium Base EMJH | BD & Company | 279410 | EMJH medium for Leptospira |
Mini-PROTEAN TGX Gels 12% | Biorad | 4568043 | Used for polyacrylamide gel eletrophoresis |
Optical density reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | For optical density measurements of bacterial cultures |
Phosphate Buffered Saline 7.4 | Sigma | 806552 | Saline solution for washing bacterial pellets |
Spectinomycin | Sigma | S0692 | Selection of pMaOri backbone plasmids |
Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher | EP0402 | Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction |
Thermocycler | Applied Biosystem | GeneAmp PCR System 9700 | Used for PCR reaction cycling |
Thymidine (dT) | Sigma | T9250 | Growth of auxotrophic E. coli π1 |
XmaI restriction enzyme | New Englan BioLabs | R0180L | Digestion of plasmids and inserts |