Burada, Leptospira türlerinde spesifik gen susturma için CRISPR parazitinin (CRISPRi) uygulanması açıklanmıştır. Leptospira hücreleri, dCas9 ‘u (katalitik olarak “ölü” Cas9) ifade eden plazmidler ve istenen genomik hedefe taban eşleştirmeden sorumlu tek kılavuzlu bir RNA (sgRNA) ile konjugasyon ile dönüştürülür. Gen susturma doğrulamak için yöntemler sunulmaktadır.
Leptospirosis, yılda en az 1 milyon vakadan ve neredeyse 60 bin ölümden sorumlu olan küresel ihmal edilmiş bir zoonozdur. Hastalık, Leptospiracinsinin patojenik ve virülan bakterilerinden kaynaklanır Bakteri ile doğrudan temas yoluyla veya dolaylı olarak kontamine suya veya toprağa maruz kalarak. Evcil ve vahşi hayvanlar, idrar yoluyla böbreğin kolonize böbrek tübüllerinden çevreye leptospires dökerek enfeksiyonun rezervuar konakları olarak hareket eder. Leptospira’nın mutant suşlarının üretimi, enfeksiyonun patojenik mekanizmalarını değerlendirmek ve anlamak için kritik öneme sahiptir. CRISPR paraziti (CRISPRi), patojenik Leptospira’dagen susturma için basit, uygun fiyatlı ve spesifik bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Bu nedenle, hem dCas9 hem de kılavuz RNA içeren plazmid yapılarının elde edilmesi, plazmidlerin E. coli suşu β2163 ile konjugasyon yapılarak Leptospira’ya teslim edilmesi ve transkonjugant geri kazanım ve değerlendirmenin metodolojik ayrıntıları açıklanacaktır. Ek olarak, yakın zamanda tanımlanan Hornsby-Alt-Nally (HAN) medyası, agar plakalarında mutant kolonilerinin nispeten hızlı izolasyonu ve seçilmesine izin verir.
Leptospirosis, Leptospiracinsinin patojenik ve virülan türlerinin neden olduğu ihmal edilmiş bir dünya zoonozdur. İnsanlarda, hastalık dünya çapında yılda bir milyondan fazla vaka ve 60.000 ölüme neden olur1,2. Şimdiye kadar, hastalık için uzun vadeli ve etkili bir aşı yoktur. Virülans faktörlerinin ve patojenik mekanizmaların tanımlanması, daha iyi terapötik ve profilaktik stratejilerin geliştirilmesi için çok önemlidir. Bu nedenle, genetik mutasyonlar üretme ve ortaya çıkan fenotipi değerlendirme yeteneği fonksiyonel genomik analiz için kritik önemesahiptir 3.
Patojenik Leptospira’da mutantların inşası, şimdiye kadar doğası gereği verimsiz, zahmetli, maliyetli ve uygulanması zor olarak kabul edildi. Bu senaryo, son CRISPR parazitinin (CRISPRi) saprofitik4 ve patojenik5 leptospire uygulanmasıyla büyük ölçüde değişti.
Gen susturma iki bileşenin ekspresyonu ile elde edilir: CRISPR / Cas’ınbir varyantı (clustered regularly interspaced s hort palindromic repeat /CRISPR sociated olarak)enzim Cas9 Streptococcus pyogenes, katalitik olarak ölü Cas9 (dCas9) ve tek kılavuzlu RNA (sgRNA) olarak adlandırılır, istenen hedefe göre düzenlenebilir6,7,8. dCas9 proteini, sgRNA’ya bağlandığında, Watson ve Crick baz eşleştirmesi tarafından belirli DNA hedeflerine yönlendirilir ve RNA polimeraz uzamasına sterik bir tıkanmaya neden olur ve tıkanmış gen transkripsiyonu nedeniyle gen susturma ile sonuçlanır7 (Şekil 1).
Bu makale, hem dCas9 hem de sgRNA’yı ifade etmek için plazmidin yapımını, donör E. coli β2163 ile alıcı Leptospira hücreleri arasındaki konjugasyonu, transkonjugant iyileşmeyi ve son olarak seçilen mutant kolonilerinin doğrulanmasını tanımlamayı amaçlamaktadır.
Patojenik15 , 16,17,18ve saprofitik19 Leptospira türlerinin erken dizilimlerinden sonra, genomun veri madenciliği leptospiral patogenezin çeşitli yönlerine ışık tutar. Çoğu durumda, protein fonksiyonu putatif leptospiral yüzeye maruz proteinlerin rekombinant muadili kullanılarak ve daha sonra yerli protein fonksiyonu20 , 21,22,23,24,25,26spekülasyonu kullanılarak araştırılmıştır.
Mutantların üretimi ve ilgili fenotiplerinin değerlendirilmesi, fonksiyonel genomik analizin temel bileşenleridir. Leptospira spp.’de mutant üretme girişimleri rastgele transposon mutajensis27 , 28,29,30; bununla birlikte, bozulan genlerin kimliğini çıkarıcı kapsamlı ve zahmetli analizlerden sonra, L. sorgulayıcıları serovar Manilae’deki tüm genlerin sadece% 15’inin bozulduğu belirtildi27. Hedeflenen gen nakavtı, istenen hedef31,32içinde homolog kollar tarafından kuşatılmış bir antibiyotik direnç kaseti sunmak için intihar plazmidleri kullanılarak homolog rekombinasyon ile daha da elde edildi.
Bu teknolojiler uygulanarak, leptospiral temel biyoloji ve virülansın çeşitli yönleri araştırıldı31,33,34,35,36,37. E. coli–Leptospira konjugatif mekik vektörü, pMaOri 11‘in gelişimi, epizomal gen susturma bileşenlerinin teslimine izin verildi.
Daha önce Cas9 kaynaklı çift iplikçik kırılmasının Leptospira spp. için ölümcül olduğu gösterilmiştir ve alternatif olarak, enzimin katalitik olarak inaktif varyantı olan dCas9, hem saprofitik hem de patojenik türlerde gen susturma elde etmek için kullanılabilir4,5. Plazmid pMaOri.dCas9’u sgRNA kaset ligasyonu için bir omurga olarak kullanarak, hem dCas9 hem de sgRNA ekspresyumu nedeniyle spesifik ve kararlı gen susturma elde edilebilir; dCas9’a bağlı sgRNA, Watson-Crick baz eşleştirmesi ile proteini istenen hedefe götürecektir.
Tam gen susturma için protospacer, istenen genin şablon zincirine göre tasarlanmalıdır, böylece sgRNA’nın taban eşleşmesi kodlama teli ile gerçekleşir. Leptospira spp.’deki ortalama %35’lik C+G içeriğine dayanarak PAM 5′-NGG-3′ her 100 bp’de en az 3 kez gerçekleşecektir. Bu nedenle, Leptospira genomunda hemen hemen her gen en az bir PAM içerecektir. Ancak NGG motifi bulunamazsa alternatif NAG motifi değerlendirilebilir.
Çinko parmaklar ve TALE (transkripsiyon aktivatör benzeri efektörler) gibi önceki gen susturma teknikleri, her hedefe bir farklı protein yapımına dayanıyordu ve bu teknikleri zahmetli ve maliyetli hale getirdi38. CRISPRi durumunda, değişken bileşen sgRNA’dır, bu da yalnızca 5′ uçtaki 20 bp’yi değiştirmeyi gerekli hale getirir. Tam, kararlı ve hedefli gen susturma sadece Leptospira spp.4,5, aynı zamanda diğer bakterilerde de gözlenmiştir 8,39,40,41.
HAN media13’ün gelişimi, koloni oluşumu için kuluçka süresini büyük ölçüde azaltarak ve Leptospira’nın C 37’de büyümesine izin vererek mutantların geri kazanılmasını tercih etti. Bununla birlikte, konjugasyon adımı sırasında, E. coli bu ortamda güçlü bir şekilde çoğalabileceğinden ve donör ve alıcı hücreler arasındaki hedeflenen 1:1 oranının üstesinden gelebileceğinden kullanılması önerilmez. Bu aşamada, EMJH artı DAP daha iyi bir seçimdir, çünkü E. coli bu medyada kötü bir şekilde çoğalr. Bazı laboratuvarların, E. coli hücrelerinin büyümesini de destekleyebilecek ek bileşenler içerebilen şirket içi takviyeli EMJH yaptığını belirtmek gerekir.
Burada sunulan konjugasyon protokolü L. sorgulayıcılar serovar Copenhageni suşu Fiocruz L1-130 için optimize edildi ve ayrıca yakın zamanda izole edilmiş patojenik bir suşun toprak örneklerinden dönüşümünde etkili olduğu kanıtlanmıştır5. L. borgpetersenii türlerinin farklı serovarları ile yapılan ilk girişimler, açıklanan protokolle daha düşük konjugasyon verimliliğine işaret eder. Bu nedenle, Leptospira’nınfarklı türleri / serovarları ile çalışırken, donör:alıcı hücre oranları, ilk hücre yoğunlukları, konjugasyon ortamı ve süresi (24 ve 48 saat) göz önünde bulundurularak, konjugasyon için en uygun koşullar ampirik olarak belirlenmelidir. Farklı Leptospira türlerinin ve serovarlarının farklı konjugasyon protokolleri ile farklı davranacağını varsaymak mantıklıdır.
Saprofitik Leptospira kolonilerinin plakalarda görselleştirilmesi nispeten kolay olsa da, patojenik kolonileri gözlemlemek daha zor olabilir. Normalde% 0.4 tavşan serumu ve spektinomisin ile desteklenmiş HAN medyası kullanılarak, transkonjugan koloniler 10. Deneyimlerimize göre, koloniler başlangıçta medya yüzeyinde şeffaf bir hale olarak bulunurlar. Video protokolünde, şeffaf olanların çekilmesi zor olduğu için 14 günlük büyümeden sonra daha yoğun koloniler gösterilmiştir. Bu aşamada, farklı ışık insidansı elde etmek için plakayı döndürmek ve beyaz ve koyu arka planlar arasında geçiş yapmak kolonileri tanımlamaya yardımcı olabilir.
Mutant doğrulaması için, immünobotting basit bir yaklaşım sunar; bununla birlikte, antikorlar hedef proteinlere karşı her zaman mevcut olmadığından, gen susturmasını doğrulamak için alternatif stratejiler izlenebilir. Hedef gen için astarlar kullanan nicel ters transkriptaz PCR (qRT-PCR) ve sgRNA güdümlü dCas9 gen transkripsiyonunun tıkanmasının sorumlusu olduğundan, konsitülatif kontrol gen susturma doğrulamak için etkilidir. Hedef gen protein jellerinde açıkça tanımlanmış bir protein bandını kodlarsa, SDS-PAGE susturma gösterebilir ve lipL32 gen susturma5. LPS biyosentez genleri susturulursa, LPS boyama kullanılabilir; iyi tanımlanmış substratlara sahip enzimler için kodlanan genlerin susturması durumunda, kromojenik substratlara sahip kinetik tahliller geçerli stratejilerdir; L. biflexa’da β-galaktozdaz susturma X-gal ve ONPG (orto-Nitrophenyl-β-galaktoside) substratları4kullanılarak doğrulandı.
Gen susturma teyid edildikten sonra, fenotipi daha fazla değerlendirmek için deneyler tasarlanabilir. Bakteriyel adezlerin susturması durumunda bağlayıcı tahliller yapılabilir; serum-challenge tahlilleri, Patojenik Leptospira5tarafından görüntülenen serum sağkalımında LigA ve LigB’nin rolünü doğruladı. Mutantlar, virülansın zayıflamasını değerlendirmek için hayvanları aşılamak için de kullanılabilir; Bu durumda, mutant ile aşılanan hayvanlar sadece pMaOri.dCas9 içeren hücrelerle enfekte olanlarla karşılaştırılmalıdır.
Sonuç olarak, mevcut protokol, 10 gün içinde mutant iyileşmesini kolaylaştırmak için HAN medyasını kullanan patojenik Leptospira türlerinde gen susturma için CRISPRi uygulamasını açıklar. Gen susturma fonksiyonel genomik analiz ile birlikte Leptospirapatojenik mekanizmaları anlamamızı geliştirecek ve sonuçta hastalık kontrolü için daha iyi profilaktik stratejilerin geliştirilmesine yol açacaktır.
The authors have nothing to disclose.
USDA fırsat eşitliği sağlayıcısı ve işverenidir. Bu yayında ticari adlardan veya ticari ürünlerden bahsedilmesi yalnızca belirli bilgileri sağlamak içindir ve ABD Tarım Bakanlığı’nın tavsiyesi veya onayı anlamına gelmez. Brezilya ajansı FAPESP (grant 2014/50981-0) bu çalışmayı finansal olarak destekledi; LGVF, FAPESP’ten (2017/06731-8 ve 2019/20302-8) burs ile finanse edilir. Fon sağlayıcılar çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, yayınlama kararı veya makale hazırlamada hiçbir rol oynamamışlardır. Yazarlar ayrıca USDA Görsel Hizmetler’den Hannah Hill ve Alexander Grimes’a video protokolünü çektirip düzenlediklerinden dolayı teşekkür ediyor.
0.1 µm pore size mixed cellulose esters membrane | Millipore | VCWP02500 | Filtration for bacterial conjugation |
2,6-Diaminopimelic acid (DAP) | Sigma | D1377 | Growth of auxotrophic E. coli β2163 |
Agar Noble | BD & Company | 214230 | Used for preparation of solid EMJH and HAN plates |
Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Used for preparation of solid LB plates |
Clarity Western ECL substrate | Biorad | 170-5060 | Chemiluminescent substrate |
dNTP set | Thermo Fisher | 10297-018 | dNTPs for PCR reaction |
Glass Microanalysis Filter Holder | Millipore | XX1012530 | Filtration for bacterial conjugation |
Imaging System | Biorad | ChemiDoc MP | Chemiluminescence detection |
LB broth, Miller | BD & Company | 244620 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
Leptospira Enrichment EMJH | BD & Company | 279510 | Supplementation of EMJH media |
Leptospira Medium Base EMJH | BD & Company | 279410 | EMJH medium for Leptospira |
Mini-PROTEAN TGX Gels 12% | Biorad | 4568043 | Used for polyacrylamide gel eletrophoresis |
Optical density reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | For optical density measurements of bacterial cultures |
Phosphate Buffered Saline 7.4 | Sigma | 806552 | Saline solution for washing bacterial pellets |
Spectinomycin | Sigma | S0692 | Selection of pMaOri backbone plasmids |
Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher | EP0402 | Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction |
Thermocycler | Applied Biosystem | GeneAmp PCR System 9700 | Used for PCR reaction cycling |
Thymidine (dT) | Sigma | T9250 | Growth of auxotrophic E. coli π1 |
XmaI restriction enzyme | New Englan BioLabs | R0180L | Digestion of plasmids and inserts |