Describimos aquí, el establecimiento y la aplicación de una línea de reportero de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (denominada αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a continuación) para la evaluación de reprogramación cardíaca. Los fibroblastos cardíacos neonatales (NCF) aislados de la cepa del ratón se convierten en cardiomiocitos inducidos (iCM), lo que permite una evaluación conveniente y eficiente de la eficiencia de reprogramación y la maduración funcional de los iCM a través del flujo de calcio (Ca2 +).
La reprogramación cardíaca se ha convertido en una terapia potencialmente prometedora para reparar un corazón dañado. Al introducir múltiples factores de transcripción, incluidos Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), los fibroblastos se pueden reprogramar en cardiomiocitos inducidos (iCM). Estos iCM, cuando se generan in situ en un corazón infartado, se integran eléctrica y mecánicamente con el miocardio circundante, lo que lleva a una reducción en el tamaño de la cicatriz y una mejora en la función cardíaca. Debido a la eficiencia, pureza y calidad de reprogramación relativamente bajas de los iCM, la caracterización de los iCM sigue siendo un desafío. Los métodos utilizados actualmente en este campo, incluida la citometría de flujo, la inmunocitoquímica y la qPCR, se centran principalmente en la expresión de genes y proteínas específicas del corazón, pero no en la maduración funcional de los iCM. Desencadenada por potenciales de acción, la apertura de canales de calcio dependientes de voltaje en los cardiomiocitos conduce a una rápida afluencia de calcio en la célula. Por lo tanto, cuantificar la tasa de afluencia de calcio es un método prometedor para evaluar la función de los cardiomiocitos. Aquí, el protocolo introduce un método para evaluar la función de iCM por flujo de calcio (Ca2+). Se estableció una cepa de ratón αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 cruzando ratones Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (denominado Myh6-Cre a continuación) con ratones Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (denominados Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a continuación). Los fibroblastos cardíacos neonatales (NCF) de ratones neonatales P0-P2 se aislaron y cultivaron in vitro, y se introdujo una construcción policistrónica de MGT en los NCF, lo que llevó a su reprogramación a iCM. Debido a que solo los iCM reprogramados con éxito expresarán el reportero GCaMP3, la maduración funcional de los iCM se puede evaluar visualmente mediante flujo de Ca2 + con microscopía de fluorescencia. En comparación con los NCF no reprogramados, los NCF-iCM mostraron un flujo transitorio significativo de calcio y una contracción espontánea, similar a los CM. Este protocolo describe en detalle el establecimiento de cepas de ratones, el aislamiento y la selección de corazones de ratones neonatales, el aislamiento de NCF, la producción de retrovirus para la reprogramación cardíaca, la inducción de iCM, la evaluación del flujo de Ca2 + de iCM utilizando nuestra línea reportera, y el análisis estadístico relacionado y la presentación de datos. Se espera que los métodos descritos aquí proporcionen una plataforma valiosa para evaluar la maduración funcional de los iCM para estudios de reprogramación cardíaca.
El infarto de miocardio (IM) es una enfermedad grave en todo el mundo. Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte en todo el mundo y representan aproximadamente 18,6 millones de muertes en 20191,2. La mortalidad total de las ECV ha disminuido durante el último medio siglo. Sin embargo, esta tendencia se ha ralentizado o incluso revertido en algunos países subdesarrollados1, lo que exige tratamientos más eficaces de las ECV. Como una de las manifestaciones fatales de las ECV, el IM representa aproximadamente la mitad de todas las muertes atribuidas a las ECV en los Estados Unidos2. Durante la isquemia, con el bloqueo de las arterias coronarias y el suministro limitado de nutrientes y oxígeno, el miocardio sufre cambios metabólicos severos, deteriora la función sistólica de los cardiomiocitos (CM) y conduce a la muerte de la CM3. Se han explorado numerosos enfoques en la investigación cardiovascular para reparar la lesión cardíaca y restaurar la función del corazón lesionado4. La reprogramación cardíaca directa se ha convertido en una estrategia prometedora para reparar el corazón dañado y restaurar su función5,6. Al introducir Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), los fibroblastos pueden reprogramarse a iCM in vitro e in vivo, y esos iCM pueden reducir el área de la cicatriz y mejorar la función cardíaca7,8.
Aunque la reprogramación cardíaca es una estrategia prometedora para el tratamiento del IM, sigue habiendo una serie de desafíos. En primer lugar, la eficiencia, la pureza y la calidad de la reprogramación no siempre son tan altas como se esperaba. La inducción de MGT solo puede alcanzar el 8,4% (cTnT+) o el 24,7% (αMHC-GFP+) del total de CF que se reprogramarán a iCM in vitro7, o hasta el 35% de vivo8, lo que limita su aplicación. Incluso con más factores inducidos en el sistema, como Hand29 o Akt1 / PKB10, la eficiencia de reprogramación sigue siendo apenas satisfactoria para ser utilizada en un entorno clínico. Por lo tanto, se necesitan más estudios centrados en mejorar la eficiencia de la reprogramación en este campo. En segundo lugar, la integridad eléctrica y las características de contracción de los iCM son importantes para la mejora eficiente de la función cardíaca, sin embargo, son difíciles de evaluar. Actualmente, los métodos de evaluación ampliamente utilizados en el campo, incluida la citometría de flujo, la inmunocitoquímica y la qPCR de la expresión de algunos genes clave de CM, se centran en la similitud de los MCi y los CM, pero no están directamente relacionados con las características funcionales de los MCI. Además, esos métodos tienen procedimientos relativamente complicados y requieren mucho tiempo. Mientras que los estudios de reprogramación generalmente implican una detección de posibles factores de reprogramación que promueven la maduración de los iCM11, la reprogramación cardíaca requiere un método rápido y conveniente basado en la función de los iCM.
Los CM abren los canales iónicos de calcio dependientes de voltaje en la citomembrana durante cada ciclo de contracción, lo que conduce a una afluencia transitoria de iones de calcio (Ca2 +) desde el líquido intercelular al citoplasma para participar en la contracción del miofilamento. Tal ciclo de afluencia y salida de Ca2+ es el rasgo fundamental de la contracción miocárdica y constituye la función normal de los CM12. Por lo tanto, un método que detecte la afluencia de Ca2 + podría ser una forma potencial de medir la función de los CM y las células similares a CM, incluidos los iCM. Además, para los iCM, este método proporciona otra forma de evaluar la eficiencia de la reprogramación.
Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) se han desarrollado y utilizado ampliamente para indicar las actividades celulares, especialmente los potenciales de acción. En general, los GECI consisten en un dominio de unión a Ca2 + como la calmodulina, y un dominio fluorescente como GFP, y GCaMP3 es uno con alta afinidad e intensidad de fluorescencia. El dominio de fluorescencia de GCaMP3 se activará cuando se cambie la concentración local de calcio13. En este artículo, se describe una cepa de ratón que expresa específicamente un reportero GCaMP3 en células Myh6+. Al introducir MGT en los NCF aislados de neonatos de esta cepa, la reprogramación puede ser monitoreada por fluorescencia, que exhibirá iCM reprogramados con éxito. Tal tensión y método de ratón proporcionará una plataforma valiosa para investigar la reprogramación cardíaca.
La evaluación de la función de los iCM es necesaria para el campo de la reprogramación cardíaca. En este manuscrito, el protocolo describe una cepa de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J cepa de ratón que se ha establecido, cómo utilizar los NCF aislados de los ratones neonatales en esta cepa para la reprogramación a iCM, y la evaluación de la función de iCM por flujo de Ca2+ . Este es un método de novo para evaluar la maduración funcional de los iCM.</p…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos los esfuerzos de Leo Gnatovskiy en la edición del texto en inglés de este manuscrito. La figura 1 se creó con BioRender.com. Este estudio fue apoyado por la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de los Estados Unidos (1R01HL109054) al Dr. Wang.
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |