Bu kolaylaştırılmış protokol, karmaşık doku örneklerindeki bakterileri tespit etmek ve görüntülemek için, dokuyu sabitlemekten floresan in situ hibridizasyonlu mikropları boyamaya kadar bir iş akışını detaylandırıyor.
Mikropların in vivo bağlamlarında lokalizasyonunu ölçmek, mikrobiyota ve omurgalı bağırsak arasındaki fonksiyonel ilişkileri ortaya çıkarmak için önemli bir adımdır. Bağırsak mikrobiyotasının mekansal manzarası fiziksel özellikler – bağırsak mukusu, mahzenler ve kıvrımlar – tarafından sıkı bir şekilde kontrol edilir ve pH, oksijen kullanılabilirliği ve bağışıklık faktörleri gibi konak kontrollü özelliklerden etkilenir. Bu özellikler, kommensal mikropların ve patojenlerin bağırsakları bıçakla kolonileştirme yeteneğini sınırlar. Mikron ölçeğinde mikrobiyal organizasyon, farklı mikroplar arasındaki yakın mesafe etkileşimlerinin yanı sıra mikroplar ve konakları arasındaki etkileşimleri de belirler. Bu etkileşimler daha sonra büyük ölçekli organ fonksiyonunu ve konak sağlığını etkiler.
Bu protokol, bağırsak mikrobiyota mekansal organizasyonunun hücreler arasındaki mesafelerden organ çapındaki ölçeklere kadar görselleştirilmesini sağlar. Yöntem, bağırsak yapısını ve mukus özelliklerini korurken bağırsak dokularını sabitleyene dayanır. Sabit numuneler daha sonra floresan in situ hibridizasyonu (FISH) yoluyla belirli bakteri türlerini vurgulamak için gömülür, bölümlenir ve lekelenir. Mukus ve konak hücre bileşenleri gibi ana bilgisayar özellikleri floresan etiketli lektinlerle etiketlenir. Son olarak, lekeli bölümler, mikron ila santimetre uzunluğundaki ölçekleri köprülemek için yüksek büyütmede karo tarama görüntülemesi kullanan bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenir. Bu tür görüntülemeler, sağlık ve hastalıkta bağırsaktaki mikrobiyotanın biyogeografisini belirlemek için hayvan modellerinden bağırsak bölümlerine ve insan dokularından biyopsilere uygulanabilir.
Mikrobiyal görselleştirme teknikleri, Antonie Van Leeuwenhoek’in mikroskobunu kullanarak 17. O zamandan beri, bir konak-mikrobiyota1 ile ilişkili yaşayan bakteri, mantar ve virüs konsorsiyumunun mekansal organizasyonunu görselleştirmek için çok sayıda teknik geliştirilmiştir. Bu mikropların lokalizasyonunu kolaylaştırmak, hayvan konaklarında işlevlerini belirlemek için gereklidir. Bakterilerin biyojeografisi, kommensal ve patojenik taksonlarda önemlidir, çünkü belirli yerlere (örneğin epitel), besinsel substratlara ve belirli mikroplara yakınlık, türlerin ve krallıklar arası etkileşimlerin altında kalan metabolitlerin bakteriyel üretimini dikte edebilir.
Ağız boşluğu, bağırsak veya akciğer gibi çeşitli farklı vücut bölgelerindeki bakterileri ve konak dokuları ayıran önemli bir yapı mukus – hem konak epitel hücrelerine mikrobiyal translokasyonu önleyen hem de mikrobiyota için beslenme kaynağı görevi görür2,3,4 . Bu bariyerdeki ihlalleri ve değişiklikleri karakterize etmek, tek başına sıralanarak elde edilmeyecek konak-mikrobiyota etkileşimleri hakkında mekanistik içgörüye yol açan önemli bir öneme sahiptir5,6,7. Örneğin, görüntüleme, antibiyotik maruziyetinin mukus tabakasını ve mikrobiyota organizasyonunu bozabileceğinin keşfedilmesini sağladı7,8 ve müshillerin mukusu yetersiz hale getirince bağışıklık parametrelerindeki büyük değişikliklerle ilişkili olabilir5.
Bu protokol, Johansson ve Hansson9’un çalışmaları üzerine inşa edilen mikrobiyota ve konak dokusunun sabitlenerek, boyanarak ve görüntülenmesi için genel bir çerçeveyi özetlemektedir (Şekil 1). Bu protokol bağırsak bölümleri bağlamında modellenirken, diğer doku tiplerine kolayca uyarlanabilir. Bu protokol, deneysel hayvan veya insan klinik örneklerinin işlenmesini sağlar; her iki tür numunenin işlenmesine ilişkin notlar eklenmiştir. Burada sunulan örnekte, konak epitel ve luminal bakteriler aynı anda 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) boyama, floresan (FITC) konjuge lektin ile mukus, Ulex europaeus aglutinin I (UEA-1) ve FISH kullanılarak belirli bir bakteri takson ile etiketlenmiştir. FISH probları genellikle bir taksonun 16S rRNA genlerine karşı, yüksek kopya transkriptinin bağlanmasından yüksek sinyali sağlamak için tasarlanmıştır.
Bu örnekte, prob Muribaculaceae bakteri ailesinin 16S rRNA’sını hedeflememektedir (Şekil 2). Bununla birlikte, lekeler uygun biyolojik soruyu karşılamak için farklı FISH probları ve / veya lektinlerle kolayca ikame edilir. Önceden doğrulanmış FISH probları, rRNA hedefli oligonükleotid probları için çevrimiçi bir kaynak olan ProbeBase10’da veya bir ribozomal RNA veritabanı olan SILVA11’de bulunabilir. Yeni probların tasarımı için okuyucu HiPR-FISH8 veya Oligominer12 gibi yeni işlem hatlarına başvurabilir. Bu protokolü kullanarak, bağırsak lümeninde bakterilerin yakın paketlenmesi ve sindirim sistemi boyunca bağırsak mukusunun farklı özelliklerini gözlemlemek mümkündür. Burada açıklanan iş akışı, mikrobiyotanın konak ortamının uzamsal bağlamında nicel analizini sağlar.
Yukarıda açıklanan protokol, ana bilgisayar mikrobiyota arabirimini görselleştirmek için yeniden oluşturulebilir bir yöntem sağlar. Bu tahliller, FISH etiketleme18’in optimizasyonundan başlayarak mukus koruma ve görüntülemeye kadar protokol geliştirmeden önemli ölçüde yararlanmıştır9. Fiksasyon ve gömme de örneklerin yararlı depolanmasını sağlar; ayrıca, numuneler tamamen sabit ve hareketsiz olduğu için parafin sızmış kasetler herhangi bir kısıtlama olmadan postalanabilir.
Anlam ve alternatif yöntemler
FISH ve mukus boyama kombinasyonu, belirli doku yerlerinde mikrobiyota bileşiminin analizini ve bireysel bakteriler ile konak arasındaki etkileşimi sağlar. Mikrobiyota içindeki belirli bölgelerin analizini içeren alternatif teknikler genellikle bu etkileşimlerin tek hücreli doğasını keşfedemez, örneğin lazer yakalama mikrodisksiyonu durumunda sıralama19 ile birleştiğinde. Bununla birlikte, sıralama tabanlı teknikler, mikrobiyotanın genetik makyajını daha ince bir seviyede ve 16S rRNA problarından daha geniş bir şekilde yakalayabilme avantajına sahiptir.
Sunulan protokolün bir tuzak, ana bilgisayarla ilgili olarak mikrobiyotanın tek seferlik bir anlık görüntüsünü sağlamasıdır. Canlı hayvanlarda gerçek zamanlı görüntüleme için derin dokuda floresan sinyali alımını kolaylaştırmak için özel görüntüleme teknikleri gereklidir (örneğin, intravital iki foton mikroskopisi ve ışık tabakası floresan mikroskopi20,21). Bu yöntemlerde, model organizma ya zarflarına bağlanan moleküllerle lekelenmiş bakterilerle kolonize edilir20 ya da floresan proteinleri barındıran genetiği değiştirilmiş bakteriler21. İkinci durumda, floresan proteinlerin olgunlaşması önemli bir konudur, çünkü çoğu standart floresan protein ışık yaymak için oksijen gerektirir. Bu nedenle, aerobik zebra balığı gut21 gibi en az nanaerobik ortamlara (nanomolar oksijen konsantrasyonu) sahip model organizmalar gereklidir.
Bu protokolde metanol-Karnoy su içermediği için paraformaldehit veya formalin yerine fiksatif olarak kullanılmaktadır. Bu, işleme sırasında mukus tabakasının hidrasyonunu, dehidratasyonunu ve çökmesini önler ve mukus kalınlığının doğru ölçümlerini kolaylaştırır. Methakarn fiksasyonu ve parafin gömme alanında bir standart haline gelmişken, mukus korumasını optimize etmek için farklı fiksatifler ve gömme teknikleri araştırılmıştır9,22, bazı çalışmalar reçinelerin parafin gömmeden daha üstün olabileceğini gösterir22. Parafin gömme ve metakarn fiksasyonu için bir diğer önemli sınırlama, alternatif fiksatifler (örneğin, formalin veya paraformaldehit (PFA)) veya değiştirilmiş gömme teknikleri23 kullanılarak önlenebilen floresan protein floresan kaybıdır23. Her sabitleyicinin yararları ve dezavantajları vardır ve sabitleyicinin seçimi görüntüleme önceliklerine bağlıdır. Pfa ve metakarnda biyolojik çoğalmalar sabitlenirse ve her iki örnekten de görüntüler elde edilirse görüntüleme yöntemleri birleştirilebilir.
FISH, spesifik anti-Muc2C3 tavşan poliklonal antikorları ile izole edilmiş örneklerde immünofluoresans ile birleştirilmiştir9,24. Bu sonuçlar diğer Muc2 antikorları ile yaygın olarak çoğaltılamamıştır, bu da FISH-immünofluoresans kombinasyonunun başarısında antikor seçiminin kritik olabileceğini göstermektedir. Belirli bir antikor için başarılı antikor lekeleme koşulları BALIK lekelemenin tutulmasına izin vermeyebilir.
Sorun giderme
Bu protokolde, örnek toplama, bölümleme ve boyama, görüntüleme yapıtlarının oluşturulmasını önlemek için kritik adımları temsil eder. Örneğin, toplama sırasında ve gömülmeden önce dokuya basmak mikrobiyotanın yanlış hesaplanmasına yol açabilir ve mukus kalitesini etkileyebilir. Bir diğer önemli husus, ince bağırsağın nispeten boş bir parçası ve distal kolon içindeki bir pelet gibi çok farklı kalınlıklardaki parçaların tek bir kasette birleştirilmesinden kaçınmaktır. Farklı kalınlıklar görüntülemede zorluklara yol açar: gömmeden sonra, bir segment için belirli bir derinlikte enine kesitleme, diğeri için görüntüleme için yanlış derinlikte olabilir (örneğin, lümen her doku için farklı derinliklerde olacaktır) (Şekil 1B,C ve Şekil 3A). Ayrıca, hayvan modeli dışkı peletlerini görüntülemek için periton membranlarına sarılabilirler24. Bu teknikte, taze izole peritonun küçük bir bölümü dışkının etrafına hafifçe katlanır ve protokolde belirtilen yıkama adımları sırasında peletin yapısını korur.
Hayvan dokusunun içerikle işlenmesinin aksine, insan bağırsak örneklerinin görüntülenmesi bazı zorluklar ortaya koyuyor. Özellikle, luminal içerik ve mukozal astar muhtemelen kolonoskopi bağırsak hazırlığı genellikle bağırsak biyopsileri veya rezeksiyon işlemlerinden önce gerçekleştirilir. Ek olarak, biyopsiler toplandığında, bağırsak içeriğinin yokluğunda belirli özelliklerin (örneğin, lümen ve submucosa) tanımlanmasına yardımcı olmak için doku yönelimini not etmek yararlıdır. % 3 agar ve / veya agar: jelatin karışımları ile ön gömme doku polaritesini korumada yararlı olabilir25; bununla birlikte, literatürde bildirildiği gibi agarın susuz kalması ve bölümlenilmesi ile ilgili sorunlar vardır ve işlem sürelerinin değiştirilmesi gerekebilir.
İyi BALIK boyama elde etmenin önemli bir yönü, belirli FISH probları için formamid konsantrasyonu ayarlamaktan gelir. Formamide, FISH problarının hedeflerine melezleme sıkılığını kontrol edecektir. a) belirli bir topluluğu lekeleme için uygun formamid konsantrasyonu seçilmesini ve b) kullanılan prob kombinasyonu için uygun bir formamid konsantrasyonu bile mümkün olduğundan emin olmak önemlidir-bu, birden fazla prob kullanırken en uygun prob seçimini etkileyebilir. MathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) gibi web siteleri, belirli bir prob için uygun formamid konsantrasyonlarının hesaplanmasına yardımcı olabilir. Uygun formamid konsantrasyonları hakkında bilgi yokluğunda, bu protokol% 0 ve% 10 formamid ile test edilebilir.
Gömülü örneklerin bölümlere ayırılmak, bir bloğa çok sığ bir şekilde bölmek, parlak içeriği olmayan villi/mahzenlerin kesitsel görünümüne neden olacağından, bloğun parlak dilimler elde etmek için yeterli bir derinliğe kesilmesini gerektirir (Şekil 3A). En uygun FISH sinyali için kesitlemeden kısa bir süre sonra örnekleri lekelenin ve arka plan sorunlarını çözmek için taze DAPI (veya -20 °C’de depolanan DAPI) kullanın (Şekil 3C). Balik bir aydan daha eski olan bölümlerin lekelenerek daha zayıf/tutarsız lekeler oluşabilir.
Doku veya kapak kayması slayt açısından mükemmel bir şekilde düz değilse, örnek bir karo taraması (Şekil 3B) içindeki her pozisyonda odakta olmayabilir ve bu da boşa harcanan çabaya ve potansiyel fotobleachinge yol açabilir. Bu, tüm konumların odakta olduğu doğrulanan daha küçük döşeme taramaları alınarak çözülebilir. Donuk bıçaklarla kesitleme, görüntüleme sırasında geniş karanlık alanlar olarak görünen mukus ve ışık içeriğinin de kopmasını sağlayabilir. Son olarak, melezleme adımı sırasında çözeltinin veya kabarcıkların buharlaşması, dokudaki FISH problarının düzensiz lekelenmesine neden olabilir.
FISH prob bağlamasının verimliliğini etkileyen bir diğer kritik parametre de farklı problar arasındaki rekabettir. FISH probunun bakterileri etiketlediğini doğrulamak için yararlı bir kontrol, FISH probundan gelen sinyalin DAPI ile kolokalizasyonunu incelemektir (Şekil 2C, D). Birden fazla rRNA probunun kullanılmasını gerektiren örneklerde, hibridizasyon sıcaklığı, prob konsantrasyonu ve formamid gibi parametrelerin ayarlanması, probların doğru türlere verimli bir şekilde bağlanmasını sağlamak için kritik hale gelir18.
Görüntüleme hakkında notlar
BALIK lekeli bakteriler en iyi konfokal mikroskop ve en az 40 kat büyütme hedefi kullanılarak görselleştirilir. Bakterileri tek hücre seviyesinde görüntülemek için 63x büyütme tercih edilirken, dijital yakınlaştırmayı en üst düzeye çıkararak veya süper çözünürlüklü bir sistem kullanılarak 40x büyütme de kullanılabilir. Süper çözünürlük yeteneklerine sahip sistemler, bireysel bakteri hücrelerinin alt hücresel çözünürlüğünü de sağlayabilir. Genel bir bakteri lokalizasyonu ve mukus kalınlığı hissi elde etmek için daha düşük büyütme hedeflerinden yararlanılabilir.
8 bit görüntüler yerine 16 bit görüntüler elde etmek de şiddetle tavsiye edilir, çünkü daha yüksek dinamik aralık, epitelin son derece parlak çekirdeklerinden ve parlak bakterilerin nispeten zayıf sinyalinden DAPI sinyalinin geniş yelpazesini yakalamaya yardımcı olacaktır. Yukarıda açıklanan görüntüleme kurulumunu kullanmanın yanı sıra, önemli bir görüntüleme değerlendirmesi florofor seçimidir. Bakteri türleri arasında en iyi ayrım için, kullanılan floroforların ekscitasyon ve emisyon spektrumunda çakışmamasını sağlayın (doğrusal karıştırma yapma yeteneğine sahip bir sistemde görüntüleme olmadıkça). Ek olarak, problar ek topluluk üyelerini tanımlamak için birlikte kullanılabilir (örneğin, aileye özgü bir prob ve cinse özgü bir probun kombinasyonu). Doğrusal karıştırmayan veya doğrulanmamış problar kullanıyorsanız, saf kültürler üzerinde FISH boyamanın doğruluğunu ve seviyesini test etmek önemlidir8,14.
Görüntüler toplandıktan sonra, ana bilgisayar mikrobiyota arabiriminin nicel analizi için BacSpace26, HiPR-FISH8 ve diğer segmentasyon araçları27 gibi birden fazla araç kullanılabilir. BacSpace, doku ve ışık bileşenlerinin segmentasyonuna ve bitki materyalinin görüntülerden uzaklaştırılmasına izin veren bir MATLAB yazılımıdır26. Program ayrıca mukus kalınlığının 2D olarak analiz edilmesini ve farklı kanallardaki piksel mesafelerine göre mekansal dağılımın nicelleştirilmesini sağlar26. Tersine, HiPR-FISH Görüntü Analizi yazılımı FISH lekeli hücrelerin segmentasyonuna izin verir8. Son olarak, in vitro deneyler için optimize edilmiş diğer bakteri segmentasyon araçları27 de bu uygulamaya uyarlanabilir.
Son
Yerinde görüntüleme, diğer topluluk üyeleri ve diyet, mukus ve konak epitel mahzenleri tarafından oluşturulan çeşitli mikroçevreler bağlamında bireysel mikrobiyal taksonların nicel analizini sağlar. Organizmalar arasındaki etkileşim, konakla ilişkili mikrobiyal sistemlerin biyolojisini belirler ve pertürbasyon sırasında bu yapılardaki değişimin sağlık için etkileri olan temel bir analizini sağlar. Özellikle, yukarıda açıklanan protokol aracılığıyla mikrobiyotayı yerinde görüntüleyebilme yeteneği, hayvan konağı ile ilgili olarak mikrobiyotanın biyogeografisine inanılmaz bir pencere sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar paha biçilmez teknik geliştirme için Dr. Kristen Earle’e, sorun giderme yardımı için Amber Hann’a, makalenin eleştirel incelemesi için Dr. Jen Nguyen ve Deanna Pepin’e ve mikroskop erişimi sağladıkları için British Columbia Üniversitesi’ndeki Dr. Hesham Soliman ve Rossi laboratuvarına teşekkür etmek istiyor. Yazarlar CIHR Team Grant: Canadian Microbiome Initiative 2 (C.T.), Crohn’s ve Colitis Canada’dan (C.T.’ye) destek kabul ediyorlar. ve K.M.N.), CIFAR (C.T. ve K.M.N.’ye), Michael Smith Sağlık Araştırma Bursiyeri Ödülü (C.T.’ye), Weston Vakfı: Weston Aile Mikrobiyom Girişimi (C.T.’ye), Paul Allen Seçkin Araştırmacı Ödülü (C.T.’ye).
Aluminum foil | |||
Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
Ethanol, anhydrous, molecular grade | — | — | |
FISH probes | |||
FISH hybridization solution | — | — | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
FISH washing buffer | — | — | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
Forceps | |||
Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
Fumehood | |||
Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Kimwipes | |||
Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
Microtome | for sectioning | ||
Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
Sodium chloride | Fisher | S271 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |