Piattaforma di coltura d'organo del segmento anteriore per il monitoraggio delle lesioni Open Globe e delle prestazioni terapeutiche

Summary

Le lesioni agli occhi open globe possono non essere trattate per più giorni in scenari rurali o militari rilevanti, con conseguente cecità. Le terapie sono necessarie per ridurre al minimo la perdita della vista. Qui, descriviamo in dettaglio un modello di lesione open globe per la coltura di organi. Con questo modello, le potenziali terapie per stabilizzare queste lesioni possono essere valutate correttamente.

Abstract

Le lesioni open globe hanno scarsi risultati visivi, spesso con conseguente perdita permanente della vista. Ciò è in parte dovuto a un ritardo prolungato tra lesioni e interventi medici in ambienti rurali e applicazioni di medicina militare in cui l’assistenza oftalmica non è prontamente disponibile. Le lesioni non trattate sono suscettibili di infezione dopo che l’occhio ha perso il suo sigillo a tenuta stagna, così come la perdita di vitalità tissutale a causa dell’ipotensione intraoculare. Le terapie per sigillare temporaneamente le lesioni a globo aperto, se adeguatamente sviluppate, possono essere in grado di ripristinare la pressione intraoculare e prevenire l’infezione fino a quando non è possibile un’adeguata cura oftalmica. Per facilitare lo sviluppo del prodotto, qui è dettagliato l’uso di una piattaforma di lesioni open globe per la coltura di organi del segmento anteriore per il monitoraggio delle prestazioni terapeutiche per almeno 72 ore dopo l’infortunio. Il tessuto del segmento anteriore suino può essere mantenuto in piatti di coltura di organi progettati su misura e mantenuto a pressione intraoculare fisiologica. Le lesioni da foratura possono essere create con un sistema pneumatico in grado di generare lesioni fino a 4,5 mm di diametro, simili alle dimensioni delle lesioni rilevanti per l’esercito. La perdita di pressione intraoculare può essere osservata per 72 ore dopo l’infortunio confermando la corretta induzione della lesione e la perdita della tenuta stagna dell’occhio. Le prestazioni terapeutiche possono essere monitorate mediante applicazione all’occhio dopo l’induzione della lesione e quindi il monitoraggio della pressione intraoculare per più giorni. Inoltre, il modello di lesione del segmento anteriore è applicabile ai metodi ampiamente utilizzati per il monitoraggio funzionale e biologico della fisiologia del segmento anteriore, come la valutazione della trasparenza, della meccanica oculare, della salute dell’epitelio corneale e della vitalità dei tessuti. Nel complesso, il metodo qui descritto è un passo successivo necessario verso lo sviluppo di terapie biomateriali per sigillare temporaneamente le lesioni a globo aperto quando la cura oftalmica non è prontamente disponibile.

Introduction

Le lesioni a globo aperto (OG) possono causare la perdita permanente della vista se non trattate o almeno stabilizzate a seguito di^{lesioni 1}. I ritardi, tuttavia, sono prevalenti in aree remote in cui l’accesso all’intervento oftalmico non è prontamente disponibile, come nelle aree rurali o sul campo di battaglia in scenari militari. Quando il trattamento non è prontamente disponibile, l’attuale standard di cura è quello di proteggere l’occhio con uno scudo rigido fino a quando non è possibile l’intervento medico. In medicina militare, questo ritardo è attualmente fino a 24 ore, ma si prevede che aumenterà fino a 72 ore nelle future operazioni di combattimento in ambienti urbani in cui l’evacuazione aerea non è possibile^2,3,4. Questi ritardi possono essere ancora più lunghi nelle applicazioni civili rurali e remote in cui l’accesso all’intervento oftalmico è limitato^5,6. Una lesione OG non trattata è altamente suscettibile alle infezioni e alla perdita di pressione intraoculare (IOP) a causa della compromissione della tenuta stagna dell’occhio^7,8. La perdita di IOP può influire sulla vitalità dei tessuti, rendendo improbabile qualsiasi intervento medico per ripristinare la vista se il ritardo tra lesione e terapia è troppo lungo⁹.

Per consentire lo sviluppo di terapie facili da applicare per sigillare le lesioni OG fino a quando non è possibile raggiungere uno specialista oftalmico, è stato precedentemente sviluppato un modello di lesione OG da banco^10,11. Con questo modello, sono state create lesioni ad alta velocità in interi occhi suini mentre la IOP è stata catturata dai trasduttori di pressione. Le terapie possono quindi essere applicate per valutare la loro capacità di sigillare il sito di lesione OG¹². Tuttavia, poiché questo modello utilizza occhi suini interi, può solo valutare le prestazioni terapeutiche immediate senza alcun modo di monitorare le prestazioni a lungo termine attraverso la possibile finestra di 72 ore in cui il terapeutico deve stabilizzare il sito della lesione fino a quando il paziente non raggiunge cure specialistiche. Di conseguenza, un modello di lesione OG della coltura d’organo del segmento anteriore (ASOC) è stato sviluppato e dettagliato in questo protocollo come piattaforma per il monitoraggio delle prestazioni terapeutiche a lungo termine¹³.

ASOC è una tecnica ampiamente utilizzata per il mantenimento del tessuto avascolare del segmento anteriore, come la cornea, per più settimane post-enucleazione^14,15,16,17. Il segmento anteriore viene mantenuto sotto IOP fisiologica perfondendo il fluido a portate fisiologiche e preservando la regione di deflusso della rete trabecolare, il tessuto responsabile della regolazione della IOP, durante la configurazione ASOC^18,19. La piattaforma ASOC può mantenere fisiologicamente il tessuto, indurre una lesione OG utilizzando un dispositivo pneumatico, applicare una terapia e tracciare la stabilizzazione della lesione per almeno 72 ore dopo l’infortunio¹³.

Qui, il protocollo fornisce una metodologia passo-passo per l’utilizzo della piattaforma ASOC. Per prima cosa descrive in dettaglio come configurare e fabbricare la piattaforma ASOC. Successivamente, il protocollo descrive in dettaglio come sezionare asetticamente il segmento anteriore e mantenere la rete trabecolare, seguita dalla creazione di tessuto del segmento anteriore in piatti di coltura di organi personalizzati. Quindi, descrive in dettaglio come creare lesioni open globe e applicare la terapia immediatamente dopo l’infortunio. Infine, il protocollo fornisce una panoramica sui parametri di caratterizzazione che sono possibili per l’uso con questo metodo che valuta le proprietà funzionali, meccaniche e biologiche dell’occhio e quanto bene la lesione è stata stabilizzata. Nel complesso, questo modello fornisce una piattaforma tanto necessaria per accelerare lo sviluppo del prodotto per stabilizzare e trattare le lesioni open globe e migliorare la prognosi della vista sfavorevole dopo l’infortunio.

Protocol

Prima di eseguire questo protocollo, essere consapevoli del fatto che esistono requisiti legali ed etici per l’uso degli animali nella ricerca e nella formazione. Se gli animali vivi vengono utilizzati per la fonte di tessuto oculare, chiedere l’approvazione dell’autorità etica o legale locale (IACUC o comitato etico, ecc.) prima di iniziare. Se c’è qualche dubbio nell’ottenere l’approvazione per l’uso di animali, non procedere. In precedenza abbiamo determinato e riportato che gli occhi suini freschi ottenuti e utiliz…

Representative Results

Le immagini acquisite tramite tomografia a coerenza ottica (OCT) vengono mostrate per gli occhi feriti OG per illustrare come appare un’induzione di lesioni di successo. La Figura 3 mostra le immagini per il controllo e il tessuto AS danneggiato da OG immediatamente dopo l’infortunio e 72 ore dopo. Vengono mostrate due viste: immagini in sezione trasversale attraverso il sito della lesione e proiezione di intensità massima (MIP) dall’alto verso il basso per visualizzare l’area della superfi…

Discussion

Ci sono passaggi critici con la piattaforma di lesioni ASOC OG che dovrebbero essere evidenziati per migliorare la probabilità di successo quando si utilizza la metodologia. In primo luogo, durante la dissezione del segmento anteriore, preservare la rete trabecolare è essenziale ma difficile da fare correttamente. Se la Meditazione Trascendentale viene interrotta, l’occhio non manterrà la pressione fisiologica e non soddisferà i criteri di ammissibilità per l’uso sperimentale. Si raccomanda di praticare prima il pro…

Materials

10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector	McMaster-Carr	51525K431
10-32 Socket cap screw, ½"	McMaster-Carr	92196A269
10 mL syringe	BD	302995
20 mL syringe	BD	302830
Anti-Anti	Gibco	15240-096
Ball-End L key	McMaster-Carr	5020A25
Betadine	Fisher Scientific	NC1696484
BD Intramedic PE 160 Tubing	Fisher Scientific	14-170-12E
Cotton swabs	Puritan	25-8061WC
DMEM media	ATCC	30-2002
FBS	ATCC	30-2020
Fine forceps	World Precision Instruments	15914
Gauze	Covidien	8044
Gentamicin	Gibco	15710-064
Glutamax	Gibco	35050-061
High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID	McMaster-Carr	5233T47
Large forceps	World Precision Instruments	500365
Large surgical scissors	World Precision Instruments	503261
Medium toothed forceps	World Precision Instruments	501217
Nail (puncture object)	McMaster-Carr	97808A503
Nylon syringe filters	Fisher	09-719C
PBS	Gibco	10010-023
Petri dish (100 mm)	Fisher	FB0875713
Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock	Fisher	NC9593742
Razor blade	Fisher	12-640
Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle	McMaster-Carr	75165A81
Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle	McMaster-Carr	75165A675
Sterile 100 mL beakers with lids	VWR	15704-092
Vannas scissors	World Precision Instruments	WP5070