Visualizando a formação de babados de membrana usando microscopia eletrônica de varredura
Summary
Macropinocistose é um processo endoctico altamente conservado iniciado pela formação de projeções de membrana semelhantes a folhas f-actin, também conhecidas como babados de membrana. O aumento da taxa de internalização do soluto macropinocético tem sido implicado em várias condições patológicas. Este protocolo apresenta um método para quantificar a formação de babados de membrana in vitro usando microscopia eletrônica de varredura.
Abstract
O babado da membrana é a formação de saliências de membrana plasmática motil contendo uma malha de filamentos de actina recém-polimerizados. Os babados de membrana podem se formar espontaneamente ou em resposta a fatores de crescimento, citocinas inflamatórias e ésteres de phorbol. Algumas das saliências da membrana podem se reorganizar em babados de membrana circular que se fundem em suas margens distais e formam copos que fecham e se separam no citoplasma como vacuoles grandes e heterogêneos chamados macropinossomos. Durante o processo, babados prendem fluido extracelular e solutos que internalizam dentro de macropinossomos. Microscopia eletrônica de varredura de alta resolução (SEM) é uma técnica de imagem comumente usada para visualizar e quantificar a formação de babados de membrana, saliências circulares e copos macropinócticos fechados na superfície celular. O protocolo a seguir descreve as condições de cultura celular, estimulação da formação de babados de membrana in vitro e como corrigir, desidratar e preparar células para imagem usando SEM. Quantificação de babados de membrana, normalização de dados e estimuladores e inibidores da formação de babados de membrana também são descritos. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre o papel da macropinocistose nos processos fisiológicos e patológicos, investigar novos alvos que regulam a formação de babados de membrana e identificar estimuladores fisiológicos ainda não característicos, bem como novos inibidores farmacológicos da macropinocise.
Introduction
Macropinocistose é um processo endocítico responsável por internalizar uma grande quantidade de fluido extracelular e seu conteúdo através da formação de saliências dinâmicas e de membrana plasmática acionadas por atolética chamadas babadosde membrana 1. Muitos desses babados de membrana formam copos que se aproximam e se fundem de volta à célula e se separam da membrana plasmática como endosários intracelulares grandes e heterogêneos também conhecidos como macropinossomos1. Embora a macropinocitose seja induzida por fatores de crescimento como fator estimulante da colônia de macrófago (M-CSF) e fator de crescimento epidérmico (EGF) em uma ampla gama de tipos celulares, um processo adicional único, dependente de cálcio conhecido como macropinocose constitutiva também foi observado em imunes inatas 2,3,4, 5, 6, 7,8.
A capacidade das células de internalizar material extracelular via macropinocise tem mostrado desempenhar um papel importante em uma variedade de processos fisiológicos que vão desde a captação de nutrientes até a captura de patógenos e apresentação de antígenos 9,10,11. No entanto, como esse processo não é seletivo e induível, também foi implicado em uma série de condições patológicas. De fato, estudos anteriores sugeriram que a macropinocitose desempenha um papel importante na doença de Alzheimer, doença de Parkinson, câncer, nefriese e aterosclerose 12,13,14,15,16. Além disso, certas bactérias e vírus têm mostrado utilizar a macropinocitose para obter entrada em células hospedeiras e induzir a infecção17,18. Curiosamente, a estimulação da macropinocitose também pode ser explorada para a entrega direcionada de agentes terapêuticos em diversas condições da doença19,20.
Estudos anteriores exploraram a macropinocitose quantificando marcadores internalizados de fase fluida com marcação fluorescente na ausência e presença de agentes farmacológicos que inibem a macropinocitose usando citometria de fluxo e imagem confocal21,22. Atualmente, as ferramentas farmacológicas disponíveis que inibem a macropinocistose estão limitadas e compreendem 1) inibidores de polimerização de actina (citochalasina D e latrunculinas), 2) bloqueadores pi3K (LY-290042 e wortmannin) e 3) inibidores de trocadores de hidrogênio de sódio (NHE) (amiloride e EIPA)5,14,15,23,24,25 . No entanto, como esses inibidores têm efeitos independentes da endocitose, é difícil determinar seletivamente a contribuição da macropinocise para a absorção de solutos e patogênese da doença especialmente in vivo21.
A microscopia eletrônica de varredura (SEM) é um tipo de microscópio eletrônico que produz imagens de ultra-alta resolução de células usando um feixe focalizado de elétrons26. Na pesquisa de macropinocistose, a imagem SEM é considerada a técnica padrão-ouro para visualizar características topográficas e morfológicas da membrana plasmática, quantificar a formação de babados de membrana e investigar sua progressão para a internalização macropinosa. Além disso, a varredura da microscopia eletrônica combinada com a quantificação da absorção de soluto, na presença e ausência de bloqueadores de macropinocise, fornece uma estratégia confiável para examinar a internalização do soluto macropinocistótico in vitro. Este artigo fornece um protocolo detalhado sobre como preparar células para SEM, visualizar a superfície celular, quantificar a formação de babados e examinar seu progresso para o fechamento do copo e internalização macropinosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente protocolo de imagem SEM fornece uma ferramenta para visualizar e quantificar a formação de babados de membrana, saliências circulares e copos macropinócticos na superfície celular in vitro. Embora o protocolo atual se concentre em macrófagos, estudos têm demonstrado que a formação de babados de membrana também ocorre em vários outros tipos celulares, incluindo células dendríticas, fibroblastos, neurônios e células cancerosas 11,12,14,21,30.<sup class="…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Libby Perry (Universidade Augusta) por sua ajuda com a preparação da amostra SEM. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [R01HL139562 (G.C.) e K99HL146954 (B.S.)] e American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)].
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | |||
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