Visualización de la formación de volantes de membrana mediante microscopía electrónica de barrido
Summary
La macropinocitosis es un proceso endocítico altamente conservado iniciado por la formación de proyecciones de membrana en forma de lámina rica en F-actina, también conocidas como volantes de membrana. El aumento de la tasa de internalización de solutos macropinocitóticos se ha implicado en diversas condiciones patológicas. Este protocolo presenta un método para cuantificar la formación de volantes de membrana in vitro utilizando microscopía electrónica de barrido.
Abstract
El rufilo de membrana es la formación de protuberancias de membrana plasmática móvil que contienen una malla de filamentos de actina recién polimerizados. Los volantes de membrana pueden formarse espontáneamente o en respuesta a factores de crecimiento, citoquinas inflamatorias y ésteres de forbol. Algunas de las protuberancias de la membrana pueden reorganizarse en volantes circulares de membrana que se fusionan en sus márgenes distales y forman copas que se cierran y separan en el citoplasma como vacuolas grandes y heterogéneas llamadas macropinosomas. Durante el proceso, los volantes atrapan el líquido extracelular y los solutos que se internalizan dentro de los macropinosomas. La microscopía electrónica de barrido (SEM) de alta resolución es una técnica de imagen comúnmente utilizada para visualizar y cuantificar la formación de volantes de membrana, protuberancias circulares y copas macropinocíticas cerradas en la superficie celular. El siguiente protocolo describe las condiciones de cultivo celular, la estimulación de la formación de volantes de membrana in vitro y cómo fijar, deshidratar y preparar células para imágenes utilizando SEM. También se describe la cuantificación del ruflejo de la membrana, la normalización de datos y los estimuladores e inhibidores de la formación de volantes de membrana. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el papel de la macropinocitosis en los procesos fisiológicos y patológicos, investigar nuevos objetivos que regulan la formación de volantes de membrana e identificar estimuladores fisiológicos aún no caracterizados, así como nuevos inhibidores farmacológicos de la macropinocitosis.
Introduction
La macropinocitosis es un proceso endocítico responsable de internalizar una gran cantidad de líquido extracelular y su contenido a través de la formación de protuberancias dinámicas y de membrana plasmática impulsadas por actina llamadas volantes de membrana1. Muchos de estos volantes de membrana forman copas que se cierran y se fusionan de nuevo en la célula y se separan de la membrana plasmática como endosomas intracelulares grandes y heterogéneos también conocidos como macropinosomas1. Aunque la macropinocitosis es inducida por factores de crecimiento como el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) en una amplia gama de tipos de células, también se ha observado un proceso adicional único y dependiente del calcio conocido como macropinocitosis constitutiva en células inmunes innatas 2,3,4,5,6,7,8.
Se ha demostrado que la capacidad de las células para internalizar material extracelular a través de la macropinocitosis desempeña un papel importante en una variedad de procesos fisiológicos que van desde la absorción de nutrientes hasta la captura de patógenos yla presentación de antígenos 9,10,11. Sin embargo, debido a que este proceso no es selectivo e inducible, también se ha implicado en una serie de condiciones patológicas. De hecho, estudios previos sugirieron que la macropinocitosis juega un papel importante en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, el cáncer, la nefrolitiasis y la aterosclerosis 12,13,14,15,16. Además, ciertas bacterias y virus han demostrado utilizar la macropinocitosis para entrar en las células huésped e inducir la infección17,18. Curiosamente, la estimulación de la macropinocitosis también puede ser explotada para la administración dirigida de agentes terapéuticos en diversas condiciones de enfermedad19,20.
Estudios previos han explorado la macropinocitosis mediante la cuantificación de marcadores de fase fluida marcados fluorescentemente internalizados en ausencia y presencia de agentes farmacológicos que inhiben la macropinocitosis mediante citometría de flujo e imágenes confocales21,22. Las herramientas farmacológicas actualmente disponibles que inhiben la macropinocitosis se limitan y comprenden 1) inhibidores de la polimerización de actina (citochalasina D y latrunculinas), 2) bloqueadores PI3K (LY-290042 y wortmannin) y 3) inhibidores de intercambiadores de hidrógeno de sodio (NHE) (amilorida y EIPA)5,14,15,23,24,25 . Sin embargo, debido a que estos inhibidores tienen efectos independientes de la endocitosis, es difícil determinar selectivamente la contribución de la macropinocitosis a la absorción de solutos y la patogénesis de la enfermedad, especialmente in vivo21.
La microscopía electrónica de barrido (SEM) es un tipo de microscopio electrónico que produce imágenes de ultra alta resolución de células utilizando un haz enfocado de electrones26. En la investigación de la macropinocitosis, las imágenes SEM se consideran la técnica estándar de oro para visualizar las características topográficas y morfológicas de la membrana plasmática, cuantificar la formación de volantes de membrana e investigar su progresión hacia la internalización de macropinosomas. Además, la microscopía electrónica de barrido combinada con la cuantificación de la absorción de solutos, en presencia y ausencia de bloqueadores de macropinocitosis, proporciona una estrategia confiable para examinar la internalización de solutos macropinocitóticos in vitro. Este documento proporciona un protocolo detallado sobre cómo preparar las células para SEM, visualizar la superficie celular, cuantificar la formación de volantes y examinar su progreso hacia el cierre de la copa y la internalización del macropinosoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente protocolo de imágenes SEM proporciona una herramienta para visualizar y cuantificar la formación de volantes de membrana, protuberancias circulares y copas macropinocíticas en la superficie celular in vitro. Aunque el protocolo actual se centra en los macrófagos, los estudios han demostrado que la formación de volantes de membrana también ocurre en varios otros tipos de células, incluidas las células dendríticas, los fibroblastos, las neuronas y las células cancerosas</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Libby Perry (Universidad de Augusta) por su ayuda con la preparación de la muestra SEM. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [R01HL139562 (G.C.) y K99HL146954 (B.S.)] y la Asociación Americana del Corazón [17POST33661254 (B.S.)].
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | |||
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