प्राथमिक और अमर मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं पर यूवी विकिरण और रसायनों की विषाक्तता का निर्धारण
Summary
यह लेख प्राथमिक और अमर सेल लाइन पर यूवी विकिरण और रासायनिक विषाक्त पदार्थों की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाओं का वर्णन करता है।
Abstract
यह लेख प्राथमिक (पीएचसीईसी) और अमर (आईएचसीईसी) मानव कॉर्नियल उपकला कोशिका संस्कृतियों पर पराबैंगनी (यूवी) विकिरण और ओकुलर विषाक्त पदार्थों की विषाक्तता को मापने के तरीकों का वर्णन करता है। कोशिकाओं को यूवी विकिरण और बेंजालकोनियम क्लोराइड (बीएके), हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 ओ2),और सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) की विषाक्त खुराक के संपर्क में लाया गया था। चयापचय गतिविधि को चयापचय परख का उपयोग करके मापा गया था। भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई को मल्टी-प्लेक्स इंटरल्यूकिन (आईएल)-13, आईएल -6, आईएल -8, और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (टीएनएफ -α) परख का उपयोग करके मापा गया था, और फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके व्यवहार्यता के लिए कोशिकाओं का मूल्यांकन किया गया था।
सेल चयापचय गतिविधि और साइटोकिन रिलीज पर यूवी के हानिकारक प्रभाव आईएचसीईसी के लिए यूवी एक्सपोजर के 5 मिनट और पीएचसीईसी के लिए 20 मिनट पर हुए। आईएचसीईसी और पीएचसीईसी की चयापचय गतिविधि में समान प्रतिशत गिरावट बीएके, एच 2 ओ2, या एसडीएस के संपर्क में आने के बाद हुई, और आईएल -6 और आईएल -8 के लिए साइटोकिन रिलीज में सबसे महत्वपूर्ण परिवर्तन हुए। फ्लोरोसेंटली सना हुआ आईएचसीईसी और पीएचईसी बीएके-उजागर कोशिकाओं की माइक्रोस्कोपी ने 0.005% बीएके एक्सपोजर पर कोशिका मृत्यु दिखाई, हालांकि पीएचईसी की तुलना में आईएचसीईसी में एथिडियम धुंधलाहोने की डिग्री अधिक थी। माइक्रोस्कोपी, चयापचय गतिविधि के आकलन और साइटोकिन उत्पादन का उपयोग करके विषाक्त प्रभावों का आकलन करने के कई तरीकों का उपयोग करते हुए, यूवी विकिरण और रासायनिक विषाक्त पदार्थों की विषाक्तता को प्राथमिक और अमर सेल लाइनों दोनों के लिए निर्धारित किया जा सकता है।
Introduction
इन विट्रो टॉक्सिकोलॉजी अध्ययन रसायनों और अन्य एजेंटों के विषाक्त प्रभावों की भविष्यवाणी करने के लिए किया जाता है जो कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकते हैं। कॉर्निया के लिए विषाक्तता के आकलन में, मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं (एचसीईसी) का उपयोग इन प्रभावों के मूल्यांकन के लिए मॉडल में किया गया है 1,2,3,4। ये मॉडल आमतौर पर शारीरिक प्रभावों का मूल्यांकन करते हैं जैसे कि सेल की चयापचय गतिविधि, सेल प्रसार, और अन्य सेल कार्यों जैसे कि भड़काऊ साइटोकिन्स का उत्पादन और रिलीज। इन विष विज्ञान अध्ययनों के लिए, एचसीईसी 2,3 पर रसायनों और यूवी विकिरण के हानिकारक प्रभावों का आकलन करने के लिए विभिन्न स्रोतों से कोशिकाओं का चयन किया गया है। पीएचईसी लाइनें उन कंपनियों से उपलब्ध हैं जो वयस्कों के दाता ऊतकों से इन कोशिकाओं को प्रदान करती हैं। प्राथमिक कोशिकाओं को डिस्पेस के साथ इलाज किया जा सकता है और धीरे से कल्चर5 के लिए कॉर्निया से स्क्रैप किया जा सकता है। कोशिकाओं को तब वायरस और संदूषण के लिए परीक्षण किया जाता है और फिर 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड में क्रायोसंरक्षित भेज दिया जाता है।
प्राथमिक सेल लाइनों का लाभ यह है कि कोशिकाएं आनुवंशिक रूप से दाता की कोशिकाओं के समान होती हैं। यह आदर्श है, क्योंकि एक इन विट्रो मॉडल को जितना संभव हो सके विवो ऊतक की नकल करनी चाहिए। प्राथमिक सेल लाइनों का नुकसान यह है कि उनके पास सीमित संख्या में कोशिका विभाजन या मार्ग6 हैं। उपलब्ध कोशिकाओं की सीमित संख्या उन प्रयोगों की संख्या को प्रतिबंधित करती है जिन्हें एकल प्राथमिक संस्कृति के साथ आयोजित किया जा सकता है, जिससे प्रयोगों की लागत बढ़ जाती है।
अमर सेल लाइनों का उपयोग सेल कल्चर विषाक्तता मॉडल में भी किया गया है। हालांकि, विवो ऊतक से प्राप्त प्राथमिक सेल लाइन के विपरीत, अमर सेल लाइन को आनुवंशिक रूप से बदल दिया गया है। अमर कोशिकाओं को प्राथमिक कोशिकाओं 6,7,8 के डीएनए में वायरस के जीन को शामिल करके बनाया जाता है। सफल वायरल जीन निगमन वाली कोशिकाओं को अमर सेल लाइन के लिए चुना जाता है। अमरीकरण का लाभ यह है कि यह अनिश्चित तेजी से प्रसार की अनुमति देता है, एक ही सेल लाइन का उपयोग करके कई प्रयोगों को करने के लिए असीमित संख्या में कोशिकाओं को प्रदान करता है। यह प्रयोगों के बीच स्थिरता की अनुमति देता है और लागत को कम करता है।
कोशिका प्रसार को सीमित करने वाले जीन में परिवर्तन के अलावा, महत्वपूर्ण कार्यक्षमता के जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तनभी हो सकता है। इसलिए, अमर कोशिकाओं का उपयोग करने का नुकसान यह है कि वे अब विभिन्न बाहरी उत्तेजनाओं के प्रति उनकी प्रतिक्रिया के संदर्भ में विवो कोशिकाओं में मूल का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकतेहैं। तुलना में प्राथमिक और अमर मानव कॉर्नियल केराटोसाइट्स11, साथ ही अमर एचसीईसी और खरगोश कॉर्नियल उपकला प्राथमिक कोशिकाओं12 पर रसायनों के विषाक्त प्रभावों को देखना शामिल है। प्राथमिक मानव केराटोसाइट्स और अमर केराटोसाइट्स पर विषाक्त पदार्थों के प्रभावों के बीच तुलना ने कोईमहत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। इस लेख में विस्तृत तरीकों का उपयोग करते हुए, पीएचईसी और आईएचसीईसी पर यूवी विकिरण और ओकुलर विषाक्त पदार्थों की विषाक्तता का आकलन करने के लिए इन परखों की प्रभावशीलता निर्धारित की जाएगी।
आमतौर पर इन विट्रो परख में उपयोग किए जाने वाले तीन ओकुलर विषाक्त पदार्थों का चयन किया गया था: बीएके, एच 2 ओ2, और एसडीएस। बीएके आमतौर पर नेत्र समाधान 13,14 में उपयोग किया जाने वाला एक धनिक संरक्षक है,एच 2 ओ2 का उपयोग आमतौर पर संपर्क लेंस 15 को कीटाणुरहित करने के लिए किया जाता है, और एसडीएस एक आयनिक सर्फेक्टेंट है जो डिटर्जेंट और शैंपू 14 में पाया जाता है। ओकुलर विषाक्त पदार्थों के समान, यूवी विकिरण भी एचसीईसी3 को महत्वपूर्ण नुकसान पहुंचा सकता है। इसके अलावा, यूवी के लिए ओवरएक्सपोजर एक ओकुलर स्थिति पैदा कर सकता है जिसे फोटोकेराटाइटिस के रूप में जाना जाता है जो फाड़ने, प्रकाश संवेदनशीलता औरकिरकिरापन की भावना के लक्षणों की विशेषता है।
प्राथमिक सेल संस्कृतियों की एक असीमित संख्या है जिसका उपयोग किया जा सकता है और विभिन्न अमर सेल लाइनें विकसित की गई हैं। इसलिए, इन प्रकार की कोशिकाओं को शामिल करने वाले मॉडलों के बीच समानता और अंतर निर्धारित करने के लिए प्राथमिक एचसीईसी की तुलना एक अमर एचसीईसी लाइन से करने के लिए एक जांच की गई थी।
इस जांच ने यूवी और विषाक्त पदार्थों के लिए सेल शारीरिक प्रतिक्रिया पर पीएचईसी और आईएचसीईसी के बीच संभावित अंतर का आकलन करने के लिए माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया। सेल चयापचय गतिविधि और दो सेल लाइनों के लिए भड़काऊ साइटोकिन रिलीज पर यूवी विकिरण और रसायनों के प्रभावों का भी मूल्यांकन किया गया था। दो सेल लाइनों के बीच अंतर निर्धारित करने का महत्व मूल्यांकन के लिए इन सेल लाइनों के इष्टतम उपयोग को समझना है: 1) कोशिकाओं पर यूवी विकिरण का प्रभाव, 2) कोशिकाओं पर विषाक्त पदार्थों का प्रभाव, और 3) भविष्य के अध्ययनों के लिए चयापचय, सेल व्यवहार्यता और सेल साइटोकिन रिलीज में परिणामी परिवर्तन।
Protocol
Representative Results
Discussion
दो प्रकार के एचसीईसी के उपयोग में संभावित अंतर का आकलन किया गया था। कोशिकाओं को कोशिकाओं की समान सांद्रता पर एक ही माध्यम (एचओईएम) में रखा गया था और फिर यूवी विकिरण और तीन ओकुलर विषाक्त पदार्थों की छोटी ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को इस काम के लिए कोई धन नहीं मिला।
Materials
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
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