Determinación de la toxicidad de la radiación UV y los productos químicos en las células epiteliales corneales humanas primarias e inmortalizadas
Summary
Este artículo describe los procedimientos utilizados para evaluar la toxicidad de la radiación UV y las toxinas químicas en una línea celular primaria e inmortalizada.
Abstract
Este artículo describe los métodos para medir la toxicidad de la radiación ultravioleta (UV) y las toxinas oculares en cultivos primarios (pHCEC) e inmortalizados (iHCEC) de células epiteliales corneales humanas. Las células fueron expuestas a radiación UV y dosis tóxicas de cloruro de benzalconio (BAK), peróxido de hidrógeno (H2O2) y dodecil sulfato de sodio (SDS). La actividad metabólica se midió mediante un ensayo metabólico. La liberación de citoquinas inflamatorias se midió mediante un ensayo de interleucina múltiple (IL)-1β, IL-6, IL-8 y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), y se evaluó la viabilidad de las células utilizando tintes fluorescentes.
Los efectos dañinos de los rayos UV sobre la actividad metabólica celular y la liberación de citoquinas ocurrieron a los 5 min de exposición UV para iHCEC y 20 min para pHCEC. Caídas porcentuales similares en la actividad metabólica de iHCEC y pHCEC ocurrieron después de la exposición a BAK,H2O2 o SDS, y los cambios más significativos en la liberación de citoquinas ocurrieron para IL-6 e IL-8. La microscopía de células expuestas a iHCEC y pHCEC BIC teñidas con fluorescencia mostró muerte celular al 0,005% de exposición a BAK, aunque el grado de tinción de etidio fue mayor en los iHCEC que en los pHCEC. Utilizando múltiples métodos para evaluar los efectos tóxicos utilizando microscopía, evaluaciones de la actividad metabólica y producción de citoquinas, se pudo determinar la toxicidad de la radiación UV y las toxinas químicas tanto para las líneas celulares primarias como para las inmortalizadas.
Introduction
Los estudios de toxicología in vitro se realizan para predecir los efectos tóxicos de los productos químicos y otros agentes que pueden causar daño a las células. En la evaluación de la toxicidad para la córnea, se han utilizado células epiteliales corneales humanas (HCEC) en modelos para evaluar estos efectos 1,2,3,4. Estos modelos generalmente evalúan los efectos fisiológicos, como los cambios en la actividad metabólica de la célula, la proliferación celular y otras funciones celulares, como la producción y liberación de citoquinas inflamatorias. Para estos estudios toxicológicos, se han seleccionado células de diversas fuentes para evaluar los efectos nocivos de los productos químicos y la radiación UV sobre los HCEC 2,3. Las líneas pHCEC están disponibles en compañías que proporcionan estas células a partir de tejidos de donantes de adultos. Las células primarias pueden tratarse con dispasa y raspar suavemente la córnea para el cultivo5. Luego, las células se analizan para detectar virus y contaminación y luego se envían criopreservadas en dimetilsulfóxido al 10%.
La ventaja de las líneas celulares primarias es que las células son genéticamente idénticas a las células del donante. Esto es ideal, ya que un modelo in vitro debe imitar el tejido in vivo tanto como sea posible. La desventaja de las líneas celulares primarias es que tienen un número limitado de divisiones celulares o pasajes6. El número limitado de células disponibles restringe el número de experimentos que se pueden realizar con un solo cultivo primario, lo que aumenta el costo de los experimentos.
Las líneas celulares inmortalizadas también se han utilizado en modelos de toxicidad por cultivo celular. Sin embargo, a diferencia de la línea celular primaria obtenida del tejido in vivo, la línea celular inmortalizada ha sido alterada genéticamente. Las células inmortalizadas se crean incorporando los genes de un virus en el ADN de las células primarias 6,7,8. Las células con incorporación exitosa de genes virales se seleccionan para la línea celular inmortalizada. La ventaja de la inmortalización es que permite una proliferación rápida indefinida, proporcionando un número ilimitado de células para realizar múltiples experimentos utilizando la misma línea celular. Esto permite la consistencia entre los experimentos y reduce el costo.
Además de los cambios en los genes que limitaron la proliferación celular, también podrían ocurrir cambios en la expresión de genes de funcionalidad crítica9. Por lo tanto, la desventaja de utilizar células inmortalizadas es que ya no pueden representar las células originales in vivo en términos de su respuesta a diversos estímulos externos10. Las comparaciones han implicado observar los efectos tóxicos de los productos químicos sobre los queratocitos corneales humanos primarios e inmortalizados11, así como sobre los HCEC inmortalizados y las células primarias epiteliales corneales del conejo12. La comparación entre los efectos de las toxinas sobre los queratocitos humanos primarios y los queratocitos inmortalizados no mostró diferencias significativas11. Utilizando los métodos detallados en este artículo, se determinará la efectividad de estos ensayos para evaluar la toxicidad de la radiación UV y las toxinas oculares en pHCEC e iHCEC.
Se seleccionaron tres toxinas oculares comúnmente utilizadas en ensayos in vitro: BAK,H2O2y SDS. BAK es un conservante catiónico comúnmente utilizado en soluciones oftálmicas 13,14,H2O2se usa comúnmente para desinfectar lentes de contacto 15, y SDS es un tensioactivo aniónico que se encuentra en detergentes y champús 14. Al igual que las toxinas oculares, la radiación UV también puede causar daños significativos a los HCEC3. Además, la sobreexposición a los rayos UV puede causar una condición ocular conocida como fotoqueratitis caracterizada por síntomas de lagrimeo, sensibilidad a la luz y una sensación de arenilla16.
Hay un número ilimitado de cultivos celulares primarios que se pueden utilizar y varias líneas celulares inmortalizadas que se han desarrollado. Por lo tanto, se realizó una investigación para comparar los HCEC primarios con una línea de HCEC inmortalizada para determinar similitudes y diferencias entre los modelos que incorporan este tipo de células.
Esta investigación utilizó microscopía para evaluar las posibles diferencias entre pHCEC e iHCEC en la respuesta fisiológica celular a los rayos UV y las toxinas. También se evaluaron los efectos de la radiación UV y los productos químicos sobre la actividad metabólica celular y la liberación de citoquinas inflamatorias para las dos líneas celulares. La importancia de determinar las diferencias entre las dos líneas celulares es comprender el uso óptimo de estas líneas celulares para evaluar: 1) el efecto de la radiación UV en las células, 2) los efectos de las toxinas en las células y 3) los cambios resultantes en el metabolismo, la viabilidad celular y la liberación de citoquinas celulares para estudios futuros.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se evaluaron las diferencias potenciales en el uso de dos tipos de HCEC. Las células se colocaron en el mismo medio (HOEM) en concentraciones idénticas de células y luego se expusieron a períodos cortos y largos de radiación UV y tres toxinas oculares. Las dosis de radiación UV y productos químicos se seleccionaron en función de sus efectos fisiológicos, que eran lo suficientemente dañinos para las células como para producir respuestas intermedias que pudieran compararse. Los tiempos de exposición de 5 y 20 m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores no recibieron fondos para este trabajo.
Materials
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
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