Denne artikel beskriver de procedurer, der anvendes til at evaluere toksiciteten af UV-stråling og kemiske toksiner på en primær og udødeliggjort cellelinje.
Denne artikel beskriver metoderne til måling af toksiciteten af ultraviolet (UV) stråling og okulære toksiner på primære (pHCEC) og udødeliggjorte (iHCEC) humane hornhindeepitelcellekulturer. Celler blev udsat for UV-stråling og toksiske doser af benzalkoniumchlorid (BAK), hydrogenperoxid (H2O2) og natriumdodecylsulfat (SDS). Metabolisk aktivitet blev målt ved hjælp af et metabolisk assay. Frigivelsen af inflammatoriske cytokiner blev målt ved anvendelse af et multi-plex interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8 og tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) assay, og celler blev evalueret for levedygtighed ved anvendelse af fluorescerende farvestoffer.
De skadelige virkninger af UV på cellemetabolisk aktivitet og cytokinfrigivelse forekom ved 5 minutters UV-eksponering for iHCEC og 20 minutter for pHCEC. Lignende procentvise fald i metabolisk aktivitet af iHCEC og pHCEC opstod efter eksponering for BAK,H2O2eller SDS, og de mest signifikante ændringer i cytokinfrigivelse forekom for IL-6 og IL-8. Mikroskopi af fluorescerende farvede iHCEC- og pHCEC BAK-eksponerede celler viste celledød ved 0,005% BAK-eksponering, selvom graden af ethidiumfarvning var større i iHCEC’erne end pHCEC’erne. Ved hjælp af flere metoder til vurdering af toksiske virkninger ved hjælp af mikroskopi, vurderinger af metabolisk aktivitet og cytokinproduktion kunne toksiciteten af UV-stråling og kemiske toksiner bestemmes for både primære og udødeliggjorte cellelinjer.
In vitro toksikologiundersøgelser udføres for at forudsige de toksiske virkninger af kemikalier og andre stoffer, der kan forårsage skade på celler. Ved vurderingen af toksicitet for hornhinden er humane hornhindeepitelceller (HCEC) blevet anvendt i modeller til evaluering af disse virkninger 1,2,3,4. Disse modeller evaluerer typisk fysiologiske effekter såsom ændringer i cellens metaboliske aktivitet, celleproliferation og andre cellefunktioner såsom produktion og frigivelse af inflammatoriske cytokiner. Til disse toksikologiundersøgelser er celler fra forskellige kilder blevet udvalgt til at vurdere kemikaliers og UV-strålings skadelige virkninger på HCECs 2,3. pHCEC-linjer er tilgængelige fra virksomheder, der leverer disse celler fra donorvæv hos voksne. Primære celler kan behandles med dispase og forsigtigt skrabes af hornhinden til dyrkning5. Cellerne testes derefter for virus og kontaminering og sendes derefter kryopræserveret i 10% dimethylsulfoxid.
Fordelen ved primære cellelinjer er, at cellerne er genetisk identiske med donorens celler. Dette er ideelt, da en in vitro-model skal efterligne in vivo-vævet så meget som muligt. Ulempen ved primære cellelinjer er, at de har et begrænset antal celledelinger eller passager6. Det begrænsede antal celler, der er til rådighed, begrænser antallet af eksperimenter, der kan udføres med en enkelt primærkultur, hvilket øger omkostningerne ved eksperimenterne.
Udødeliggjorte cellelinjer er også blevet anvendt i cellekultur toksicitetsmodeller. I modsætning til den primære cellelinje opnået fra in vivo-væv er den udødeliggjorte cellelinje imidlertid blevet genetisk ændret. Udødeliggjorte celler skabes ved at inkorporere generne fra en virus i DNA’et i primære celler 6,7,8. Celler med vellykket viral geninkorporering vælges til den udødeliggjorte cellelinje. Fordelen ved udødeliggørelse er, at det giver mulighed for ubestemt hurtig spredning, hvilket giver et ubegrænset antal celler til at udføre flere eksperimenter ved hjælp af den samme cellelinje. Dette giver mulighed for konsistens mellem eksperimenter og reducerer omkostningerne.
Ud over ændringer i generne, der begrænsede celleproliferationen, kunne der også forekomme ændringer i ekspressionen af gener med kritisk funktionalitet9. Derfor er ulempen ved at bruge udødeliggjorte celler, at de muligvis ikke længere repræsenterer de originale in vivo-celler med hensyn til deres reaktion på forskellige eksterne stimuli10. Sammenligninger har involveret observation af kemikaliers toksiske virkninger på primære og udødeliggjorte humane hornhindekeratocytter11 samt udødeliggjorte HCEC’er og kaninhornhindepitelprimærceller12. Sammenligningen mellem toksiners virkninger på primære humane keratocytter og udødeliggjorte keratocytter viste ingen signifikante forskelle11. Ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i denne artikel, bestemmes effektiviteten af disse assays til vurdering af toksiciteten af UV-stråling og okulære toksiner på pHCEC’er og iHCEC’er.
Tre okulære toksiner, der almindeligvis anvendes i in vitro-assays, blev udvalgt: BAK,H2O2og SDS. BAK er et kationisk konserveringsmiddel, der almindeligvis anvendes i oftalmiske opløsninger 13,14,H2O2bruges almindeligvis til at desinficere kontaktlinser 15, og SDS er et anionisk overfladeaktivt middel, der findes i vaskemidler og shampoo 14. I lighed med okulære toksiner kan UV-stråling også forårsage betydelig skade på HCEC’er3. Derudover kan overeksponering for UV forårsage en okulær tilstand kendt som fotokeratitis karakteriseret ved symptomer på rive, lysfølsomhed og en følelse af grynhed16.
Der er et ubegrænset antal primære cellekulturer, der kan bruges, og forskellige udødeliggjorte cellelinjer, der er blevet udviklet. Derfor blev der foretaget en undersøgelse for at sammenligne primære HCEC’er med en udødeliggjort HCEC-linje for at bestemme ligheder og forskelle mellem modeller, der inkorporerer disse typer celler.
Denne undersøgelse brugte mikroskopi til at vurdere mulige forskelle mellem pHCEC’er og iHCEC’er på cellefysiologisk respons på UV og toksiner. Virkningerne af UV-stråling og kemikalier på cellemetabolisk aktivitet og inflammatorisk cytokinfrigivelse for de to cellelinjer blev også evalueret. Vigtigheden af at bestemme forskellene mellem de to cellelinjer er at forstå den optimale anvendelse af disse cellelinjer til evaluering: 1) effekten af UV-stråling på celler, 2) virkningerne af toksiner på celler og 3) de resulterende ændringer i metabolisme, cellelevedygtighed og cellecytokinfrigivelse til fremtidige undersøgelser.
Potentielle forskelle i anvendelsen af to typer HCEC’er blev vurderet. Celler blev placeret i samme medium (HOEM) i identiske koncentrationer af celler og derefter udsat for korte og lange perioder med UV-stråling og tre okulære toksiner. Doser af UV-stråling og kemikalier blev valgt ud fra deres fysiologiske virkninger, som var skadelige nok for cellerne til at producere mellemliggende reaktioner, der kunne sammenlignes. Eksponeringstider på 5 og 20 minutter for UV-stråling og 5 og 15 minutter for de udvalgte doser…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne modtog ingen finansiering til dette arbejde.
75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
96 well plate | costar | 3370 | |
alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590) |
Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |