Оценка противоопухолевой активности полиангидридных наночастиц IL-1α in vivo
Summary
Описан стандартный протокол для изучения противоопухолевой активности и связанной с ней токсичности IL-1α в сингенной мышиной модели HNSCC.
Abstract
Цитокиновая терапия является многообещающей иммунотерапевтической стратегией, которая может вызывать надежные противоопухолевые иммунные реакции у больных раком. Провоспалительный цитокин интерлейкин-1 альфа (IL-1α) был оценен как противоопухолевое средство в нескольких доклинических и клинических исследованиях. Тем не менее, токсичность, ограничивающая дозу, включая гриппоподобные симптомы и гипотонию, ослабила энтузиазм в отношении этой терапевтической стратегии. Доставка IL-1α на основе полиангидридных наночастиц (NP) представляет собой эффективный подход в этом контексте, поскольку это может обеспечить медленное и контролируемое высвобождение IL-1α системно при одновременном снижении токсичных побочных эффектов. Здесь описан анализ противоопухолевой активности IL-1α-нагруженных полиангидридных НПз в модели сингенной мыши с плоскоклеточным раком головы и шеи (HNSCC). Мышиные ротоглоточные эпителиальные клетки, стабильно экспрессирующие HPV16 E6/E7 вместе с клетками hRAS и люциферазы (mEERL), вводили подкожно в правый фланг мышей C57BL/6J. Как только опухоли достигали 3-4 мм в любом направлении, 1,5% IL-1a – нагруженный 20:80 1,8-бис(p-карбоксифенокси)-3,6-диоксаоктан:1,6-бис(p-карбоксифенокси)гексан (CPTEG:CPH) препарат наночастиц (IL-1α-NP) вводили мышам внутрибрюшинно. Размер опухоли и масса тела непрерывно измерялись до тех пор, пока размер опухоли или потеря веса не достигли критериев эвтаназии. Образцы крови были взяты для оценки противоопухолевых иммунных реакций с помощью подчелюстной венипунктуры, а воспалительные цитокины были измерены с помощью мультиплексных анализов цитокинов. Опухолевые и паховые лимфатические узлы были резецированы и гомогенизированы в одноклеточную суспензию для анализа различных иммунных клеток с помощью многоцветной проточной цитометрии. Эти стандартные методы позволят исследователям изучить противоопухолевый иммунный ответ и потенциальный механизм иммуностимулирующих НП и других иммунотерапевтических агентов для лечения рака.
Introduction
Одной из новых областей иммунотерапии рака является использование воспалительных цитокинов для активации иммунной системы пациентов против их опухолевых клеток. Некоторые провоспалительные цитокины (т.е. интерферон-альфа (IFNα), интерлейкин-2 (IL-2) и интерлейкин-1 (IL-1)) могут вызывать значительный противоопухолевый иммунитет, что вызвало интерес к изучению противоопухолевых свойств, а также безопасности препаратов на основе цитокинов. Интерлейкин-1 альфа (IL-1α), в частности, является провоспалительным цитокином, известным как главный цитокин воспаления1. С момента открытия этого цитокина в конце 1970-х годов он был исследован в качестве противоопухолевого агента, а также кроветворного препарата для лечения негативных последствий химиотерапии2. В конце 1980-х годов было проведено несколько доклинических и клинических исследований для определения противоопухолевых эффектов IL-1α 3,4,5,6. Эти исследования обнаружили многообещающую противоопухолевую активность рекомбинантного IL-1α (rIL-1α) в отношении меланомы, почечно-клеточной карциномы и карциномы яичников. Тем не менее, обычно наблюдались токсичности, включая лихорадку, тошноту, рвоту, гриппоподобные симптомы и наиболее серьезную гипотензию, ограничивающую дозу. К сожалению, эти токсичности, связанные с дозой, ослабили энтузиазм в отношении дальнейшего клинического использования rIL-1α.
Чтобы попытаться решить критическую проблему токсичности, опосредованной IL-1α, будут исследованы составы полиангидридных наночастиц (NP), которые допускают контролируемое высвобождение IL-1α кинетикой поверхностной эрозии. Эти NP-препараты предназначены для получения преимуществ противоопухолевых свойств IL-1α при одновременном снижении дозоограничивающих побочных эффектов7. Полиангидриды являются одобренными FDA полимерами, которые разлагаются в результате поверхностной эрозии, что приводит к почти нулевому высвобождению инкапсулированных агентов 8,9,10,11,12. Сообщалось, что амфифильные полиангидридные сополимеры, содержащие 1,8-бис-(p-карбоксифенокси)-3,6-диоксаоктан (CPTEG) и 1,6-бис-(p-карбоксифенокси)гексан (CPH), являются отличными системами доставки для различных полезных нагрузок в онкологических и иммунологических исследованиях 8,12. В следующем протоколе 20:80 CPTEG:CPH NPs, загруженные 1,5 мас.% rIL-1α (IL-1α-NPs), будут использоваться для изучения противоопухолевой активности и токсичности этого цитокина в мышиной модели HNSCC.
Общей целью следующих процедур является оценка противоопухолевой активности IL-1α-NPs на HNSCCs. Описанные процедуры, включая оценку роста и выживаемости опухоли, могут быть применены к любому иммуномодуляторному агенту, представляющему интерес. Эти процедуры должны выполняться на сингенной мышиной модели с интактной иммунной системой13 , чтобы максимизировать клиническую значимость. Токсичность IL-1α-NP также будет оцениваться путем измерения изменений в циркулирующих уровнях провоспалительных цитокинов и массе животных. Существует множество методов определения токсичности препарата in vivo ; однако наиболее широко используемые методы включают измерение сывороточных ферментов для токсичности органов и гистологических изменений в этих органах. Однако для выполнения гистологического анализа животное нужно принести в жертву, что повлияет на кривые выживаемости эксперимента. Поэтому этот протокол будет включать протокол сбора крови у живых мышей для измерения цитокинов в образцах сыворотки. Собранная сыворотка может быть использована для измерения любых желаемых сывороточных аналитов на токсичность для органов. Многоцветная проточная цитометрия будет использоваться для понимания изменений в популяции иммунных клеток в микроокружении опухоли и миграции иммунных клеток в лимфатический узел. Другие способы могут быть использованы для идентификации иммунных клеток, включая иммуногистохимию и/или иммунофлуоресценцию сохраненных участков14. Тем не менее, эти методы могут быть трудоемкими и утомительными для выполнения на большом количестве животных. В целом, следующие методы позволят исследователям изучить противоопухолевый иммунный ответ и потенциальные механизмы иммуностимулирующих агентов для лечения рака.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол позволит любому исследователю изучить противоопухолевую активность и некоторые из основных механизмов иммуномодулирующих препаратов в модельной системе опухоли in vivo . Здесь была использована модель сингенной подкожной опухоли, которая имеет несколько преимущест?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана наградой Merit Review Award #I01BX004829 из Соединенных Штатов (США). Департамент по делам ветеранов, Служба биомедицинских лабораторных исследований и разработок и поддерживается программой mezhir Award через Комплексный онкологический центр Holden в Университете Айовы.
Materials
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
Referências
- Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).
- de Mooij, C. E. M., Netea, M. G., vander Velden, W., Blijlevens, N. M. A. Targeting the interleukin-1 pathway in patients with hematological disorders. Blood. 129 (24), 3155-3164 (2017).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: a review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. Stem Cells. 14 (2), 164-176 (1996).
- Grandis, J. R., Chang, M. J., Yu, W. D., Johnson, C. S. Antitumor activity of interleukin-1 alpha and cisplatin in a murine model system. Archives of Otolaryngology- Head & Neck Surgery. 121 (2), 197-200 (1995).
- Curti, B. D., Smith, J. W. Interleukin-1 in the treatment of cancer. Pharmacology & Therapeutics. 65 (3), 291-302 (1995).
- Smith, J. W., et al. The effects of treatment with interleukin-1 alpha on platelet recovery after high-dose carboplatin. New England Journal of Medicine. 328 (11), 756-761 (1993).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Carbone, A. L., Uhrich, K. E. Design and synthesis of fast-degrading Poly(anhydride-esters). Macromolecular Rapid Communications. 30 (12), 1021 (2009).
- Gopferich, A., Tessmar, J. Polyanhydride degradation and erosion. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 911-931 (2002).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (8), 889-907 (2008).
- Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. Role of polyanhydrides as localized drug carriers. Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).
- Kumar, N., Langer, R. S., Domb, A. J. Polyanhydrides: an overview. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 889-910 (2002).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells. Molecules. 22 (6), (2017).
- Espinosa-Cotton, M., et al. Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79 (2019).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).
