piggyBac טרנספוסאז בתיווך טרנספורמציה נבטים בתולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda
Summary
טרנספורמציה נבט מוצלחת תולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda, הושג באמצעות mRNA של piggyBac היפראקטיבי transposase.
Abstract
החדרה יציבה של מטען גנטי לגנומי חרקים באמצעות אלמנטים הניתנים להחלפה היא כלי רב עוצמה למחקרים גנומיים פונקציונליים ולפיתוח אסטרטגיות לניהול מזיקים גנטיים. האלמנט הנפוץ ביותר לשינוי חרקים הוא piggyBac, ושינוי נבטים מבוסס piggyBacנערך בהצלחה בחרקים לדוגמה. עם זאת, עדיין קשה להשתמש בטכנולוגיה זו בחרקים שאינם מודל הכוללים מזיקים חקלאיים. מאמר זה מדווח על טרנספורמציה נבט של מזיק חקלאי גלובלי, תולעת צבא הסתיו (FAW), Spodoptera frugiperda, באמצעות piggyBac transposase היפראקטיבי (hyPBase).
בעבודה זו, ה- hyPBase mRNA יוצר ושימש במקום פלסמיד עוזר במיקרו-בייג’ציות עובריות. שינוי זה הוביל לדור המוצלח של FAW מהונדס. יתר על כן, מתוארים גם שיטות הסינון של בעלי חיים מהונדסים, זיהוי מהיר מבוסס PCR של החדרת טרנסג’נים וקביעה אסימטרית תרמית של PCR (TAIL-PCR) של אתר האינטגרציה. לפיכך, מאמר זה מציג פרוטוקול לייצור FAW מהונדס, אשר יקל על transgenesis מבוסס piggyBacב- FAW וחרקים לפידופטרנים אחרים.
Introduction
תולעת צבא הסתיו (FAW), Spodoptera frugiperda, היא ילידת אזורים טרופיים וסובטרופיים של אמריקה. נכון לעכשיו, זהו אוכל עשב חרקים הרסני ביותר מ -100 מדינות ברחבי העולם1. זחלי FAW ניזונים מיותר מ־350 צמחים מארחים, כולל כמה גידולי מזון חשובים2. יכולת ההגירה החזקה של בוגרי FAW תורמת להתפשטות המהירה האחרונה שלה מיבשת אמריקה למקומות אחרים1,2. כתוצאה מכך, חרק זה מאיים כעת על ביטחון המזון ברחבי העולם. יישום טכנולוגיות חדשות עשוי להקל על מחקרים מתקדמים ב- FAW ולספק אסטרטגיות חדשניות לניהול מזיק זה.
שינוי חיידקי חרקים שימש לחקר תפקוד הגנים ולייצור חרקים מהונדסים לשימוש בשליטה גנטית3,4. בין השיטות השונות המשמשות להשגת טרנספורמציה גנטית בחרקים, השיטה המבוססת על אלמנט piggyBac היא השיטה הנפוצה ביותר5. עם זאת, בשל השיעור הנמוך של טרנספוזיציה, זה עדיין מאתגר לנהל טרנסגנזה בחרקים שאינם מודל. לאחרונה, גרסה היפראקטיבית של piggyBac transposase (hyPBase) פותחה6,7. טרנספורמציה Germline הושגה לאחרונה FAW8, שהוא הדו”ח הראשון שהשתמש hyPBase חרקים lepidopteran. בדו”ח זה, מידע מפורט על שימוש hyPBase mRNA ביצירת FAW מהונדס מתואר. השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מיושמת כדי להשיג את השינוי של חרקים lepidopteran אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיעור הנמוך של טרנספוזיציה וקושי בהעברת רכיבים מהונדסים לעוברים טריים מגבילים את ההצלחה של טרנספורמציה נבטים בחרקים רבים שאינם מודל, במיוחד אלה מהסדר, לפידופטרה. כדי להגדיל את קצב הטרנספורמציה של חיידקים, גרסה היפראקטיבית של piggyBac transposase הנפוץ ביותר (hyPBase)פותחה 7,<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שדווח נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע I/UCRC, המרכז לטכנולוגיות ניהול פרוקי רגליים, תחת Grant No IIP-1821936 ועל ידי שותפים בתעשייה, חקלאות ויוזמת מחקר מזון מענק תחרותי מס ‘ 2019-67013-29351 והמכון הלאומי למזון וחקלאות, משרד החקלאות האמריקאי (2019-67013-29351 ו- 2353057000).
Materials
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
Referências
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
- Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
- Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
- Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
- Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
- Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
- Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Xu, H., O’Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
- Wu, S. C. -. Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
- Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).
