A transformação germinal bem sucedida no verme do exército de outono, Spodoptera frugiperda,foi alcançada usando mRNA de transposase hiperativo piggyBac.
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Artigo de método
Transformação germline hiperativa da Transposase mediada pela Transposase no Verme do Exército de Outono, Spodoptera frugiperda
Neste artigo
Resumo
Resumo
A inserção estável da carga genética em genomas de insetos usando elementos transposáveis é uma poderosa ferramenta para estudos genômicos funcionais e desenvolvimento de estratégias genéticas de manejo de pragas. O elemento transposável mais usado na transformação de insetos é o piggyBac, e a transformação germinal baseada em piggyBactem sido conduzida com sucesso em insetos modelo. No entanto, ainda é desafiador empregar essa tecnologia em insetos não-modelo que incluem pragas agrícolas. Este artigo relata a transformação germinal de uma praga agrícola global, a minhoca de outono (FAW), Spodoptera frugiperda,usando a transposase hiperativa piggyBac (hyPBase).
Neste trabalho, o mRNA hyPBase foi produzido e utilizado no lugar de plasmídeo de ajudante em microinjeções de embriões. Essa mudança levou à geração bem sucedida de FAW transgênico. Além disso, também são descritos os métodos de triagem de animais transgênicos, a detecção rápida da inserção transgênica baseada em PCR e a determinação assimétrica do local de integração. Assim, este artigo apresenta um protocolo para produzir FAW transgênico, o que facilitará a transgênese baseada em piggyBacna FAW e outros insetos lepidopteranos.
Introdução
O verme do exército de outono (FAW), Spodoptera frugiperda,é nativo de regiões tropicais e subtropicais da América. Atualmente, este é um herbívoro de insetos devastador em mais de 100 países em todo o mundo1. As larvas faw se alimentam de mais de 350 plantas hospedeiras, incluindo algumas importantes culturas alimentaresbásicas 2. A forte capacidade migratória dos adultos da FAW contribui para sua recente rápida disseminação das Américas para outros lugares1,2. Como resultado, este inseto está ameaçando a segurança alimentar internacionalmente. A aplica....
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Protocolo
1. Síntese in vitro de hipPBase mRNA
NOTA: A sequência completa de codificação da sequência hyPBase foi sintetizada e inserida em um vetor pTD1-Cas9 (ver a Tabela de Materiais) para produzir a construção pTD1-hyPBase, que contém um expresso em hyPBase, promotor T7: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). A sequência completa da construção pTD1-hyPBase está prevista no Material Suplementar.
- Preparação do modelo para síntese in vitro
- Execute uma reação pcr para amplificar o de expressão hyPBase usando um primer para a frente, 5'- atgcggtgtgaaccgcacagatgcg-3....
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Resultados
Uma construção para a expressão do promotor T7 contendo hippBase: poliedrin-5'UTR: hyPBase: poliedrin-3'UTR: poly (A) sinal foi gerado(Figura 1A) e amplificado como um fragmento de PCR ~2,2 kb para sintetizar hipPBase mRNA in vitro (Figura 1B). Em seguida, o mRNA hyPBase foi produzido e submetido à eletroforese de gel agarose. O mRNA do tamanho esperado (~1,1 kb de banda) foi detectado em um gel de 1% de agarose(Figura 1C)........
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Discussão
A baixa taxa de transposição e a dificuldade de entregar componentes transgênicos em embriões frescos limitam o sucesso da transformação germinal em muitos insetos não-modelo, especialmente aqueles da ordem, Lepidoptera. Para aumentar a taxa de transformação germinal, foi desenvolvida uma versão hiperativa da transposase de piggyBac mais utilizada (hyPBase)7,10. Até o momento, a transformação germinal bem sucedida em insetos lepidopteranos é relatada pri.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
A pesquisa relatada é apoiada pela National Science Foundation I/UCRC, o Center for Arthropod Management Technologies, sob o Grant No IIP-1821936 e por parceiros da indústria, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 e o National Institute of Food and Agriculture, Departamento de Agricultura dos EUA (2019-67013-29351 e 2353057000).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Rolos de Algodão Dentais de 1,5" | PlastCare USA | 8542025591 | RAISING |
| 1 oz Tampas de Copo de Soufflé | DART | PL1N | |
| 1 oz Copos de Soufflé | DART | P100N | RAISING |
| 48 oz Recipientes de Plástico | Deli Genpack | AD48 | REARING |
| Conjunto de Filtros Adicionais (Verde) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Vidro de borosilicato | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJEÇÃO |
| Vidro de borosilicato | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Escopo de dissecação | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscópio | Olympus | IX71 | INJEÇÃO |
| Microinjetor | Narishige | IM-300 | INJEÇÃO |
| Micropipeta Extrator | Sutter Instruments | P-1000 | INJEÇÃO Lâminas |
| Microscópio | VWR | 16004-22 | INJEÇÃO |
| NightSea Sistema Completo NightSea | LLC | SFA-RB-DIM | |
| TRIAGEM Nitrogênio Gás | AWG/ Toalhas de Papel Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Bounty | 43217-45074 | CRIAÇÃO | |
| em>Spodoptera frugiperda Dieta Artificial | Southland Products, Inc | N/A [Solicitar Espécie/Quantidade] | RECRIAÇÃO |
| em>Spodoptera frugiperda Ovos Benzon | Research, Inc | N/A [Solicitar Espécie/Quantidade] | CRIAÇÃO |
| Taq MasterMix | mistura de polimerase |
Referências
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al.
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Reimpressões e permissões
