Hyperaktives SchweinchenBac Transposase-vermittelte Keimbahntransformation im Herbst-Heerwurm, Spodoptera frugiperda
Summary
Eine erfolgreiche Keimbahntransformation im Herbst-Heerwurm Spodoptera frugiperdawurde unter Verwendung von mRNA der hyperaktiven PiggyBac-Transposase erreicht.
Abstract
Die stabile Insertion genetischer Fracht in Insektengenomen unter Verwendung transponierbarer Elemente ist ein leistungsfähiges Werkzeug für funktionelle genomische Studien und die Entwicklung genetischer Schädlingsbekämpfungsstrategien. Das am häufigsten verwendete transponierbare Element in der Insektentransformation ist PiggyBac, und die PiggyBac-basierteKeimbahntransformation wurde erfolgreich in Modellinsekten durchgeführt. Es ist jedoch immer noch eine Herausforderung, diese Technologie bei Nicht-Modell-Insekten einzusetzen, zu denen auch landwirtschaftliche Schädlinge gehören. Dieser Artikel berichtet über die Keimbahntransformation eines globalen landwirtschaftlichen Schädlings, des Herbstheerwurms (FAW), Spodoptera frugiperda,unter Verwendung der hyperaktiven PiggyBac-Transposase (hyPBase).
In dieser Arbeit wurde die hyPBase mRNA hergestellt und anstelle von Helferplasmid in embryonalen Mikroinjektionen verwendet. Diese Veränderung führte zur erfolgreichen Generierung von transgenem FAW. Darüber hinaus werden auch die Methoden des Screenings transgener Tiere, des PCR-basierten Schnellnachweises der Transgeninsertion und der thermischen asymmetrischen Interlaced PCR (TAIL-PCR)-basierten Bestimmung der Integrationsstelle beschrieben. Daher stellt dieses Papier ein Protokoll zur Herstellung von transgenem FAW vor, das die PiggyBac-basierteTransgenese bei FAW und anderen Lepidoptera-Insekten erleichtern wird.
Introduction
Der Herbst-Heerwurm (FAW), Spodoptera frugiperda,stammt aus tropischen und subtropischen Regionen Amerikas. Derzeit ist dies ein verheerender Insektenpflanzenfresser in mehr als 100 Ländern weltweit1. FAW-Larven ernähren sich von mehr als 350 Wirtspflanzen, darunter einige wichtige Grundnahrungsmittel2. Die starke Migrationsfähigkeit der FAW-Erwachsenen trägt zu ihrer jüngsten raschen Ausbreitung von Amerika auf andere Orte bei1,2. Infolgedessen bedroht dieses Insekt jetzt die Ernährungssicherheit auf internationaler Ebene. Die Anwendung neuer Technologien kann fortgeschrittene Studien in FAW erleichtern und neuartige Strategien zur Bekämpfung dieses Schädlings bieten.
Die Transformation der Keimbahn von Insekten wurde verwendet, um die Genfunktion zu untersuchen und transgene Insekten für die genetische Kontrolle zu erzeugen3,4. Unter den verschiedenen Methoden, die verwendet werden, um eine genetische Transformation bei Insekten zu erreichen, ist die auf PiggyBac-Elementen basierende Methode die am häufigsten verwendete Methode5. Aufgrund der geringen Transpositionsrate ist es jedoch immer noch schwierig, die Transgenese bei Nicht-Modellinsekten durchzuführen. Vor kurzem wurde eine hyperaktive Version der piggyBac Transposase (hyPBase) entwickelt6,7. Die Keimbahntransformation wurde kürzlich in FAWerreicht 8, was der erste Bericht ist, der die hyPBase bei Lepidoptera-Insekten verwendete. In diesem Bericht werden detaillierte Informationen zum Einsatz von hyPBase mRNA bei der Erzeugung transgener FAW beschrieben. Die hier beschriebene Methode könnte angewendet werden, um die Transformation anderer Lepidoptera-Insekten zu erreichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die geringe Transpositionsrate und die Schwierigkeit, transgene Komponenten in frische Embryonen zu liefern, begrenzen den Erfolg der Keimbahntransformation bei vielen Nicht-Modellinsekten, insbesondere bei Lepidoptera. Um die Keimbahntransformationsrate zu erhöhen, wurde eine hyperaktive Version der am weitesten verbreiteten PiggyBac-Transposase (hyPBase) entwickelt7,10. Bis heute wird eine erfolgreiche Keimbahntransformation bei Lepidoptera-Insekten h…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die gemeldete Forschung wird von der National Science Foundation I / UCRC, dem Center for Arthropod Management Technologies, unter der Fördernummer IIP-1821936 und von Industriepartnern, der Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant Nr. 2019-67013-29351 und dem National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture (2019-67013-29351 und 2353057000) unterstützt.
Materials
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
Referências
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