ヒト変形性膝関節からの組織採取とRNA抽出
Summary
全膝関節形成術後の患者から得られた原発組織は、変形性関節症研究の実験モデルを提供し、最大の臨床翻訳性を有する。このプロトコルは、ヒト変形性関節症における機械治療研究を支援するために、7つのユニークな膝組織からRNAを同定、処理、分離する方法を説明しています。
Abstract
変形性関節症(OA)は、最も頻繁に膝に影響を与える慢性および変性関節疾患である。現在のところ治療法がないため、全膝関節形成術(TKA)は一般的な外科的介入である。TKAから得られたヒトの初原OA組織を用いた実験は、疾患メカニズム ex vivoを調査する能力を提供する。OAは以前は主に軟骨に影響を与えると考えられていたが、現在では関節内の複数の組織に影響を与えたことが知られている。このプロトコルは、患者の選択、サンプル処理、組織均質化、RNA抽出、および(RNAの純度、完全性、収率に基づく)品質管理(RNAの純度、完全性、収率に基づく)を、膝関節における疾患メカニズムの調査をサポートする方法を説明します。インフォームド・コンセントを得て、OAのTKAを受けている患者からサンプルを入手した。組織は解剖、洗浄、およびRNAのためのフラッシュ凍結または組織学のためのホルマリン固定によって手術の4時間以内に保存された。収集された組織には、関節軟骨、軟骨下骨、半月板、眼房蓋脂肪パッド、前十字靭帯、滑膜、および斜筋の中科が含まれていた。RNA抽出プロトコルは、各組織タイプについて試験した。最も重要な改変は、比較的高細胞、低マトリックス、低マトリックス、軟部組織(脂肪パッド、靭帯、滑膜、および筋肉と考えられる)に対して、低細胞、高マトリックス、硬組織(軟骨、骨、半月板と考えられる)に使用される崩壊の方法を含んでいた。粉砕は硬質組織に適しており、軟組織には均質化が適していることが分かった。複数の組織にわたって一貫して他の被験者よりも高いRNA完全性数(RIN)値を得るためのプロクチティティが観察され、疾患重症度などの根本的な要因がRNAの質に影響を与える可能性が示唆された。ヒトの原発組織から高品質のRNAを単離する能力は、シーケンシングを含む洗練された遺伝子発現実験に生理学的に関連するモデルを提供し、患者に翻訳されやすい臨床的洞察につながる可能性があります。
Introduction
膝は人体で最大の滑液関節であり、脛骨と大腿骨と膝蓋骨と大腿骨1の間の膝蓋骨関節との間の脛骨の関節を含む。膝の骨は関節軟骨で覆われ、半月、脂肪、靭帯、筋肉を含む様々な結合組織によって支えられ、滑膜膜は関節全体を封入して滑液充填空洞1、2、3を作り出す(図1)。健康な膝は前部平面1、3の摩擦のない動きを可能にする移動式ヒンジの接合箇所として機能する。病理学的状態下では、動きは制限され、痛みを伴うことがあります。最も一般的な変性膝関節疾患は変形性関節症(OA)4である。OAの発症に大きな影響を与えるさまざまな危険因子が知られています, 高齢者を含みます, 肥満, 女性のセックス, 関節外傷, 遺伝学, とりわけ5,6.現在、米国には症候性膝OAを持つ推定1,400万人が存在し、人口年齢の上昇と肥満率7,8による罹患率が増加しています。当初は軟骨の疾患であると考えられていたが、OAは現在、関節全体9の疾患として理解されている。OAで一般的に観察される病理学的変化は、関節軟骨浸食、骨棘形成、軟骨下骨肥厚、および滑膜9、10の炎症を含む。OAに対する既知の治療法がないため、治療は主に症状(例えば、疼痛)管理11、12に焦点を当て、そしてOAが末期に進行すると、関節置換手術は13を示すことが多い。
関節置換手術は、脛骨性関節関節全体と膝蓋骨関節関節の交換を含む全膝関節形成術(TKA)を伴う部分的または完全な膝置換のいずれかであり得る。2020年現在、米国では毎年約100万件のTKUが実施されています。TKAの間、整形外科医は脛骨台の上部と下腿骨顆(図2A、2B)を補間インプラントで装着するように分け替える。時には患者によって誤解され、TKAでは、各骨の端から8〜10mmしか切除され、その後キャップまたは再浮上し、金属で覆われる。介在ポリエチレンライナーは、2つの金属インプラント間の軸受面(すなわち、パディング)を形成する。さらに、関節のいくつかの軟部組織成分は、適切な関節バランスを達成するために完全または部分的に切除される。これらの組織の中には、内側および外側の月経(図2C)、歯膜脂肪パッド(図2D)、前十字靭帯(ACL;図2E、滑膜(図2F)、及び斜筋(VMO;図2G)TKAは一般的にOA治療に成功しているが、患者の約20%が手術後の痛みの再発を報告する16。高いコストと手順の相対的な侵襲性に加えて、これらの制限は、OAの進行を軽減するための代替治療を特定するためのさらなる研究の必要性を指摘する。
治療介入のための新たな道を提示し得るOAの疾患メカニズムを探求するために、細胞、組織外植物、および動物モデルを含む実験システムを使用することができる。細胞は、典型的には、単層で培養され、原発性ヒトまたは動物組織(例えば、軟骨から単離された軟骨細胞)または不死化細胞(例えば、ATDC517 およびCHON-00118)に由来する。細胞は制御された培養環境で実験変数を操作するのに有用であるが、細胞のフェノタイプ19に影響を与えると知られている自然な関節の条件を捕捉しない。OAの基になる化学的、機械的、および細胞間通信の複雑なカスケードをより良く再現するために、代わりの代替は、一次ヒトまたは動物組織サンプルに見られ、新鮮なまたは培養された ex vivo を外植として使用するかにかかわらず、組織構造および細胞微小環境20を保存する。 生体内で関節を研究するためには、小(例えばマウス21)および大きい(例えば、馬22)OAの動物モデル(例えば、外科的誘導、遺伝的変化、または老化を通じて)も有用である。しかし、これらのモデルからヒト疾患への翻訳は、解剖学的、生理学的、および代謝の違いによって制限され得る。実験システムの長所と短所を考えると、種特異的であることと、一次ヒトOA組織が提供する細胞外ニッチを維持することの主な強みは、研究結果の翻訳可能性を最大化する。
ヒトの初発組織は、TKAに続いて容易に得られ、TKAの高頻度を研究に役立つ貴重な資源とすることができる。潜在的な実験的応用の中には、遺伝子発現および組織学的分析がある。これらの研究アプローチ等に対するヒトの主要OA組織の可能性を実現するために、以下の重要な検討事項を概説する。まず、患者検体の使用は倫理的規制の対象となり、プロトコルは機関審査委員会(IRB)の承認を満たす必要があります。第二に、ヒト原発性疾患組織の固有の異質性と、年齢や性別などの変数の影響は、とりわけ、慎重な患者の選択(すなわち、適格性基準の適用)およびデータ解釈の必要性を生み出す。第三に、関節中の異なる組織の独特な生物学的特性(例えば、軟骨および半月板25の低い細胞性)は、実験中に課題を提示することができる(例えば、RNAの質および量を高く分化する)。このレポートでは、これらの考慮事項に対応し、患者の選択、サンプル処理、組織の均質化、RNA抽出、および品質管理(RNAの純度と完全性の評価)のためのプロトコルを提示します。 図3)研究コミュニティにおける主要ヒトOA組織の使用を奨励する。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示されたプロトコルは、RNA抽出のための7つの主要なヒトOA組織を収集することに成功したことを証明しました(表1)および組織学的処理(図4)。患者のサンプルを収集する前に、理想的には外科医または外科チームと協力して、IRB承認プロトコルを確立する必要があります。試験片の収集に標準化されたプロトコル(例えば、その場での一貫した切除)を…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この研究を可能にした研究参加者に感謝し、この報告書を変形性関節症分野の新しい科学者に捧げる。
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05 402 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 10% Formalin | Cardinal Health | C4320-101 | Store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Chloroform (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | ICN19400290 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Ethanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | BP2818500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water. |
| 100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | AC327272500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Reagent Alcohol | Cardinal Health | C4305 | Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes. |
| 15 cm sterile culture dishes | Thermo Scientific | 12-556-003 | Sterile, nuclease-free. |
| 15 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 14 959 53A | Sterile, nuclease-free. |
| 2 mL cryovials (externally threaded) | Fisher Scientific | 10 500 26 | Sterile, nuclease-free. |
| 5 mL round-bottom tubes | Corning | 352052 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 50 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 12 565 271 | Sterile, nuclease-free. |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | For RNA integrity measurement. |
| Biosafety Cabinet | General lab equipment | ||
| Bone Cutters | Fisher Scientific | 08 990 | Sterilized with 70% EtOH. |
| Chemical Fume Hood | General lab equipment | ||
| Disposable Scalpels (No.10) | Thermo Scientific | 3120032 | Sterile, nuclease-free. |
| EDTA | Life Technologies | 15-576-028 | 10% solution with dH2O. |
| Forceps | Any vendor | Sterilized with 70% EtOH. | |
| Glycoblue Coprecipitant | Fisher Scientific | AM9516 | Reserved for RNA work only, store at -20 °C. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Liquid Nitrogen | Any vendor | ||
| Liquid Nitrogen Dewar | General lab equipment | ||
| Mortar and Pestle | Any vendor | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA purity and yield measurements. |
| Nuclease-free/DEPC-treated water | Fisher Scientific | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. | |
| PBS (Sterile) | Gibco | 20 012 050 | Sterile, nuclease-free. |
| Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips | Any vendor | Sterile, nuclease-free. | |
| Plasma/Serum Advanced miRNA kit | Qiagen | 217204 | |
| Refrigerated Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| RNAlater | Thermo Scientific | 50 197 8158 | Sterile, nuclease-free. |
| RNAse Away/RNAseZap | Fisher Scientific | 7002 |
|
| Spatula (semimicro size) | Any vendor | Reserved for RNA work only. | |
| Tissue homogenizer | Pro Scientific | 01-01200 | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. |
| TRIzol Reagent | Fisher Scientific | 15 596 026 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
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