인간 골관절염 무릎 관절에서 조직 수집 및 RNA 추출
Summary
총 무릎 관절 성형술 다음 환자에서 얻은 1 차 조직은 최대 임상 과격성관절염 연구를위한 실험 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 인간 골관절염에 있는 기계론적인 조사를 지원하기 위하여 7개의 유일한 무릎 조직에서 RNA를 확인, 프로세스 및 격리하는 방법을 설명합니다.
Abstract
골관절염 (OA)은 만성 및 퇴행성 관절 질환으로 무릎에 가장 자주 영향을 미칩니다. 현재 치료법이 없기 때문에 총 무릎 관절 성형술 (TKA)은 일반적인 외과 적 개입입니다. TKA에서 얻은 1 차적인 인간 OA 조직을 이용한 실험은 질병 기계장치 ex vivo를조사하는 기능을 제공한다. OA는 이전에 주로 연골에 영향을 미칠 것으로 생각 되었지만, 지금은 관절에 있는 다중 조직에 영향을 미칠 것으로 알려져 있습니다. 이 프로토콜은 무릎 관절에서 질병 메커니즘 조사를 지원하기 위해 7 개의 고유 조직에서 환자 선택, 샘플 처리, 조직 균질화, RNA 추출 및 품질 관리 (RNA 순도, 무결성 및 수율기준)를 설명합니다. 정보에 입각한 동의로, 샘플은 OA를 위한 TKA를 겪고 있는 환자에게서 얻어졌습니다. 조직은 RNA 또는 조직학을 위한 포르말린 고정을 위한 플래시 동결에 의해 수술4 시간 안에 해부, 세척 및 저장되었습니다. 수집된 조직에는 관절 연골, 연골 뼈, 반월상연골, 반골 관절 지방 패드, 전방 십자 인대, 시노비움 및 광대 한 내측 경사 근육이 포함되었습니다. RNA 추출 프로토콜은 각 조직 유형에 대해 테스트되었다. 가장 중요한 수정은 낮은 세포에 사용되는 붕괴의 방법을 포함, 높은 매트릭스, 하드 조직 (연골으로 간주, 뼈, 그리고 반월 상 연골) 상대적으로 높은 세포 대, 낮은 매트릭스, 연조직 (지방 패드로 간주, 인대, 시노비움, 근육). 분쇄가 단단한 조직에 적합하다는 것을 발견되었고, 균질화는 연조직에 적합했다. 몇몇 과목에 대한 성향은 여러 조직에 걸쳐 일관되게 다른 과목보다 더 높은 RNA 무결성 수 (RIN) 값을 산출하는 것이 관찰되었다, 질병 심각도와 같은 기본 요인이 RNA 품질에 영향을 미칠 수 있음을 시사. 1 차인간 OA 조직에서 고품질 RNA를 격리하는 기능은 환자에게 더 쉽게 번역되는 임상 통찰력으로 이어질 수 있는 시퀀싱을 포함하여 정교한 유전자 발현 실험을 위한 생리학적으로 관련된 모델을 제공합니다.
Introduction
무릎은 유골과 대퇴골 사이의 경골 관절과 슬개골과 대퇴골1사이의 파텔로페모랄 관절을 포함하는 인체에서 가장 큰 연동 관절이다. 무릎의 뼈는 관절 연골로 줄지어 있으며, 반월상, 지방, 인대 및 근육을 포함한 다양한 결합 조직에 의해 지원되며, 활막막은 전체 관절을 캡슐화하여 활액충충1,2,3(도 1)을생성한다. 건강한 무릎은 전두엽 비행기1,3에서마찰없는 움직임을 허용하는 모바일 힌지 조인트역할을 한다. 병리학적 조건하에서 이동은 제한되고 고통스러울 수 있습니다. 가장 흔한 퇴행성 무릎 관절 질환은 골관절염 (OA)4입니다. 다양한 위험 요소는 노년기, 비만, 여성 성, 관절 외상 및 유전학을 포함한 OA 발달에 걸리기 쉬운 것으로 알려져 있으며, 그중에서도 5,6. 현재 미국에서 약 1,400만 명이 증상 무릎 OA를 가지고 있으며, 인구 연령 상승과비만률7,8로인해 보급이 증가하고 있다. 처음에 연골의 질병으로 간주, OA는 이제 전체 관절9의질병으로 이해된다. OA에서 일반적으로 관찰된 병리학적 변화는 관절 연골 침식, 골체 형성, 아촌건조골 두껍게, 및 시노비움9,10의염증을 포함한다. OA에 대한 알려진 치료법이 없기 때문에, 치료는 주로 증상 (예를 들어, 통증) 관리에 초점을 맞추고11,12,그리고 일단 OA가 최종 단계로 진행되면, 관절 교체 수술은 종종13을표시한다.
관절 교체 수술은 부분 또는 총 무릎 교체 될 수 있습니다,총 무릎 관절 성형술 (TKA) 전체 경유 관절과 patellofemoral 관절을 교체 포함. 2020년 현재 미국에서는 매년14일약 100만 개의 TK가 공연된다. TKA 동안 정형 외과 의사는 유골 고원의 상부와 하부 대퇴동체(도 2A,2B)를보철 임플란트와 함께 장착합니다. 때때로 환자에 의해 잘못 해석, TKA에서, 만 8-10 mm는 금속으로, 나중에 덮여 또는 다시 표면각 뼈의 끝에서 절제된다. 분리된 폴리에틸렌 라이너는 두 금속 임플란트 사이에 베어링 표면(즉, 패딩)을 형성합니다. 또한, 관절의 몇몇 연조직 성분은 적절한 관절 균형을 달성하기 위해 완전히 또는 부분적으로 절제된다. 이들 조직 중에는 내측 및 횡월경(도2C),적외선 지방패드(도 2D),전방 십자 인대(ACL; 도 2E),시노비움(도2F),및 광두스 내측 경사 근육(VMO; 도 2G) 15. . TKA는 일반적으로 OA 치료에 성공하지만 환자의 약 20 %가 수술 후 통증의 재발을보고합니다16. 절차의 높은 비용 및 상대적 침략과 함께, 이러한 제한은 OA의 진행을 완화하기 위해 대체 치료를 식별하기 위해 추가 연구의 필요성을 가리킵니다.
치료 적 개입을위한 새로운 방법을 제시 할 수있는 OA에서 질병 메커니즘을 탐구하기 위해, 세포, 조직 각종 및 동물 모델을 포함한 실험 시스템을 사용할 수 있습니다. 세포는 전형적으로 단층에서 배양되고 1차 인간 또는 동물 조직(예를 들어, 연골으로부터 분리된 연골세포) 또는 불멸의 세포(예를 들어, ATDC517 및 CHON-00118)에서유래된다. 세포는 통제된 배양 환경에서 실험 변수를 조작하는 데 유용할 수 있지만, 세포표현형(19)에영향을 미치는 것으로 알려진 천연 조인트 조건을 포착하지 않는다. OA의 근본적인 화학, 기계 및 세포 간 통신의 복잡한 폭포를 더 잘 회수하기 위해, 조직 구조 및 세포 미세환경을보존하기 위해 신선하거나 배양된 전 생체 를 항축으로 사용하든 간에 1 차적인 인간 또는 동물 조직 샘플에서 대안이 발견된다. 생체 내에서관절을 연구하기 위해서는, 작은(예를 들어,마우스(21)과대형(예를 들어, 말22)OA에 대한 동물 모델(예를 들어, 외과 유도, 유전적 변화 또는 노화를 통해)도 유용하다. 그러나, 이러한 모델에서 인간 질환으로의 번역은 해부학적, 생리학적 및 대사적 차이에 의해 제한될 수 있으며, 그 외23. 실험 시스템의 장점과 단점을 고려, 종 특정 되 고 기본 인간 OA 조직에 의해 제공 하는 세포 외 틈새 시장을 유지의 주요 강점 연구 결과의 번역 잠재력을 극대화.
1 차적인 인간 OA 조직은 TKA 다음 쉽게 얻을 수 있습니다, 연구를 위한 귀중한 자원TAs의 고주파를 만들기. 잠재적인 실험 응용 프로그램 중 유전자 발현 및 조직 분석. 이러한 연구 접근 방식과 다른 사람에 대한 기본 인간 OA 조직의 잠재력을 실현하기 위해, 설명은 다음과 같은 주요 고려 사항입니다. 첫째, 환자 표본의 사용은 윤리적 규제의 대상이 되며, 프로토콜은 기관 검토 위원회(IRB)승인(24)을충족해야 한다. 둘째, 인간 1차 질병의 본질적인 이질성과 나이와 성별과 같은 변수의 영향은 신중한 환자 선택(즉, 자격 기준 적용) 및 데이터 해석에 대한 필요성을 조성합니다. 셋째, 관절에서 다른 조직의 고유한 생물학적 특성(예를 들어, 연골 및 반월 상연연연골(25)의낮은 세포성)은 실험 중(예: 고품질 및 RNA의 양을 격리)하는 동안 과제를 제시할 수 있다. 이 보고서는 이러한 고려 사항을 해결하고 환자 선택, 샘플 처리, 조직 균질화, RNA 추출 및 품질 관리(즉, RNA 순도 및 무결성평가)에 대한 프로토콜을 제시합니다. 그림 3) 연구 커뮤니티에서 1 차적인 인간 OA 조직의 사용을 격려하기 위하여.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 프로토콜은 RNA추출(표 1)및 조직학적 처리(도4)를위한 7개의 1차 인간 OA 조직을 수집하는 데 성공한 것으로 입증되었다. 환자 샘플을 수집하기 전에 외과 의사 또는 외과 팀과 협력하여 IRB 승인 프로토콜을 수립해야합니다. 시편 수집을 위한 표준화된 프로토콜(예: 시상 위치에서 일관된 절제)을 적용하면 실험 재현성을 극대화하는 데 필수적입니다…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 이 연구를 가능하게 하고 골관절염 필드에 있는 새로운 과학자에게 이 보고를 헌정한 연구 참가자에게 감사합니다.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05 402 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 10% Formalin | Cardinal Health | C4320-101 | Store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Chloroform (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | ICN19400290 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Ethanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | BP2818500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water. |
| 100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | AC327272500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Reagent Alcohol | Cardinal Health | C4305 | Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes. |
| 15 cm sterile culture dishes | Thermo Scientific | 12-556-003 | Sterile, nuclease-free. |
| 15 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 14 959 53A | Sterile, nuclease-free. |
| 2 mL cryovials (externally threaded) | Fisher Scientific | 10 500 26 | Sterile, nuclease-free. |
| 5 mL round-bottom tubes | Corning | 352052 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 50 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 12 565 271 | Sterile, nuclease-free. |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | For RNA integrity measurement. |
| Biosafety Cabinet | General lab equipment | ||
| Bone Cutters | Fisher Scientific | 08 990 | Sterilized with 70% EtOH. |
| Chemical Fume Hood | General lab equipment | ||
| Disposable Scalpels (No.10) | Thermo Scientific | 3120032 | Sterile, nuclease-free. |
| EDTA | Life Technologies | 15-576-028 | 10% solution with dH2O. |
| Forceps | Any vendor | Sterilized with 70% EtOH. | |
| Glycoblue Coprecipitant | Fisher Scientific | AM9516 | Reserved for RNA work only, store at -20 °C. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Liquid Nitrogen | Any vendor | ||
| Liquid Nitrogen Dewar | General lab equipment | ||
| Mortar and Pestle | Any vendor | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA purity and yield measurements. |
| Nuclease-free/DEPC-treated water | Fisher Scientific | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. | |
| PBS (Sterile) | Gibco | 20 012 050 | Sterile, nuclease-free. |
| Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips | Any vendor | Sterile, nuclease-free. | |
| Plasma/Serum Advanced miRNA kit | Qiagen | 217204 | |
| Refrigerated Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| RNAlater | Thermo Scientific | 50 197 8158 | Sterile, nuclease-free. |
| RNAse Away/RNAseZap | Fisher Scientific | 7002 |
|
| Spatula (semimicro size) | Any vendor | Reserved for RNA work only. | |
| Tissue homogenizer | Pro Scientific | 01-01200 | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. |
| TRIzol Reagent | Fisher Scientific | 15 596 026 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
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