قياس الرقم الحموضة، كيمياء الأكسدة، والقدرة التحللية للماكروبينوسومات باستخدام المجهر ثنائي الفلوروفوري نسبة القياس
Summary
نحن نصف بروتوكولات لقياس الرقم الحموضة، والأحداث التأكسدية، وهضم البروتين في الماكروبينوسومات الفردية في الخلايا الحية. يتم التركيز على المجهر المقنن ثنائي الفلوروفوري والمزايا التي يوفرها على التقنيات القائمة على السكان.
Abstract
في السنوات الأخيرة، نما مجال داء الأبين الكلي بسرعة. وقد برز داء الماكروبينوسيتوسيس كآلية مركزية تحافظ من خلالها الخلايا المناعية الفطرية على التوازن والمناعة الحية. في وقت واحد ، وعلى النقيض من دورها الهوستاتيكي ، يمكن أن تدفع أيضا أمراض مختلفة ، بما في ذلك السرطان والالتهابات الفيروسية. على عكس الأنماط الأخرى من الغدد الصماء ، لا تزال الأدوات المطورة لدراسة نضوج الماكروبينوسومات متخلفة. هنا يصف البروتوكول الأدوات المطورة حديثا لدراسة بيئة الأكسدة داخل تجويف الماكروبينوسومات المبكرة والنضج. ويرد وصف منهجيات استخدام المجهر الفلوري النسبة في تقييم الحموضة، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية، والقدرة التحللية داخل تجويف الكائنات الماكروبينوسومية الفردية في الخلايا الحية. وتوفر القياسات العضوية الواحدة ميزة الكشف عن عدم التجانس الصدغي، الذي كثيرا ما يضيع مع النهج القائمة على السكان. يتم التركيز على المبادئ الأساسية للمجهر الدقيق ثنائي الفلوروفور، بما في ذلك اختيار المسبار، والأجهزة، والمعايرة، والأساليب أحادية الخلية مقابل الخلايا السكانية.
Introduction
Macropinocytosis يشير إلى امتصاص كميات كبيرة من السائل خارج الخلية في العضيات السيتوبلازمية الغشاء ملزمة تسمى الماكروبينوسومات1،2. وهي عملية محفوظة للغاية تقوم بها الكائنات الحية الحرة أحادية الخلية ، مثل الأميبا Dictyostelium spp. 3، وكذلك anthozoans4 والميتازوان2. في معظم الخلايا، الماكروبينوسيتوسيس هو حدث مستحث. ربط مستقبلات سطح الخلية يحفز نتوء ملحقات غشاء البلازما التي يحركها أكتين المشار إليها باسم الكشكشة. جزء صغير من تلك الكشكشة، من قبل بعض آلية غير مفهومة جيدا، ختم في نصائحهم البعيدة لتشكيل macropinosomes (على الرغم من خارج نطاق هذه الورقة الأساليب، لاستعراضات مفصلة عن آليات macropinocytosis، يرجى الرجوع إلى المراجع1،2،5،6،7). التحفيز خارج الخلية الذي يحفز داء الماكروبينوسيتوسيس هو في معظم الأحيان عامل نمو قابل للذوبان5،8. وبناء على ذلك، فإن الحدث الماكروبينوسيتيك يسمح لابتلاع بولوس من المواد خارج الخلية التي يمكن للخلية استخلاص الأيض مفيدة لتسهيل النمو. لسوء الحظ ، يمكن أن يؤدي هذا المسار لتوصيل العناصر الغذائية أيضا إلى أمراض. بعض الخلايا السرطانية تؤوي الطفرات التي تؤدي إلى حدوث طفرات ماكروبينوسيتوسيس مستمرة أو تأسيسية. التسليم المستمر للمغذيات يسهل الانتشار غير المنضبط للخلايا السرطانية وقد تم ربطه بالأورام العدوانية بشكل خاص9و10و11و12و13. وبالمثل ، يمكن للفيروسات حث الماكروبينوسيتوسيس للوصول إلى الخلايا المضيفة ، وبالتالي قيادة علم الأمراضالفيروسية 14.
Macropinocytosis يعمل أيضا في الحفاظ على الحصانة ضد مسببات الأمراض. بعض الخلايا المناعية الفطرية مثل الضامة والخلايا التغصنية تشارك في أخذ العينات التأسيسية والعدوانية من السائل خارج الخلية عن طريق الماكروبينوسيتوسيس6،15،16. هذا النمط من macropinocytosis نشط بشكل لا يصدق ، ويمكن لخلية واحدة دندريتية أن تحفر نفسها بحجم من السائل خارج الخلية يعادل وزنها كل ساعة17. على الرغم من هذه العينات التأسيسية ، لا تتكرر الضامة والخلايا التغصنية بشكل لا يمكن السيطرة عليه كما تفعل الخلايا السرطانية ، بدلا من ذلك ، يبدو أنها تعالج المواد خارج الخلية بطريقة يمكن من خلال استخراج المعلومات للإبلاغ عن وجود تهديدات محتملة ، أو في الواقع غيابها. يتم استخراج المعلومات كما 1) الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض التي يمكن قراءتها من قبل مستقبلات التعرف على مسببات الأمراض داخل الخلايا و2) فترات قصيرة من الأحماض الأمينية التي يمكن تحميلها على جزيئات التوافق الهستوباتية الرئيسية لفحصها من قبل خلايا الجهاز المناعي التكيفي16،18،19. ومن غير الواضح في الوقت الحاضر ما إذا كانت مسببات الأمراض تقوض هذا المسار لمعالجة المعلومات من قبل الخلايا المناعية.
على الرغم من هذه الأدوار المحددة جيدا والحرجة لداء ماكروبينوسيتوسيس في كل من الحفاظ على المناعة والانزل وعلى النقيض من غيرها من وسائط أكثر شيوعا درس من الانطاط، ومن المعروف القليل من الأعمال الداخلية (مضيئة) من macropinosomes. تطوير بروتوكولات وأدوات موحدة لدراسة الكيمياء الحيوية الإنارة للماكروبينوسومات لن يساعدنا فقط على فهم بيولوجيتهم الفريدة بشكل أفضل ولكن سيوفر رؤية يمكن الاستفادة منها لاستراتيجيات علاجية جديدة ، بما في ذلك تسليم الأدوية20. ستركز مخطوطة الأسلوب هذه على الأدوات التي تم تطويرها مؤخرا لتشريح جوانب مختلفة من الكيمياء الحيوية الإنارة للماكروبينوسومات على مستوى الجهاز الواحد.
ويمكن استخدام الفلوروفوريس لقياس الكيمياء الحيوية المحددة للعضيات إذا كان ‘1’ تقسيمها بشكل تفضيلي إلى مقصورة الاهتمام و/أو ‘2’ أنها تخضع لتغيرات طيفية استجابة للمعلمة ذات الاهتمام. على سبيل المثال ، في حالة درجة الحموضة ، تتراكم القواعد الضعيفة الفلورية ، مثل البرتقال الأكريدين ، والبنفسجي الكريل ، وأصباغ LysoTracker بشكل تفضيلي في العضيات الحمضية. لذلك ، فإن كثافتها النسبية هي مؤشر تقريبي على أن العضية المسماة حمضية. تخضع الفلوروفورات الأخرى المستجيبة لhH، مثل الفلورسين و بهرودو وcypHer5e، لتغييرات طيفية عند ربطها بالبروتونات(الشكل 1A–C). ولذلك فإن التغيرات في انبعاث الفلوروفور الحساسة لhH يمكن أن توفر تقريب مفيد لhh. ومع ذلك، فإن استخدام الفلوروفوريس المفرد يمثل عددا من العيوب. على سبيل المثال ، يمكن أن تؤدي التغييرات في المستوى البؤري ، والbleaching ، والتغييرات في حجم العضيات الفردية ، وهو أمر شائع في macropinosomes21، إلى تغييرات في كثافة الفلورية للفلوروفورات المفردة ، ولا يمكن تصحيح هذا بسهولة لمدة22. ولذلك فإن التقييمات أحادية الطول الموجي، وإن كانت مفيدة لتصور المقصورات الحمضية، نوعية بحتة.
وهناك نهج أكثر كمية هو استهداف الفلوروفور الحساس للمعلمة جنبا إلى جنب مع الفلوروفورا المرجعية إلى العضية ذات الاهتمام. الفلوروفور المرجعي غير حساس بشكل مثالي للتغيرات الكيميائية الحيوية داخل العضية (الشكل 1D–F) ، وبالتالي يمكن استخدامه لتصحيح التغيرات في المستوى البؤري ، وحجم organellar ، وإلى حد ما ، photobleaching23. وباستخدام هذا النهج، الذي يشار إليه باسم الفلورسين القياسي المزدوج الفلوري، يمكن تحقيق التصحيح بتوليد نسبة من الانبعاثات الفلورية للفلوروفور الحساس للمعلمة إلى الفلوروفور المرجعي.
هنا، سيستخدم البروتوكول مبدأ التصوير المعدل المزدوج للفلوروفوري لقياس الحموضة، والأحداث التأكسدية، وتدهور البروتين داخل الماكروبينوسومات. في كل حالة، سيتم اختيار الفلوروفور الحساس للمعلمة ذات الاهتمام والفلوروفور المرجعي. من أجل استهداف الفلوروفوريس على وجه التحديد إلى الماكروبينوسومات ، سيتم اقترانها بشكل متناقض إلى 70 kDa dextran ، والتي يتم دمجها بشكل تفضيلي في macropinosomes24. سيتم إجراء جميع المقايسات في خلايا Raw264.7 ولكن يمكن تكييفها مع أنواع الخلايا الأخرى. حيثما أمكن، سيتم معايرة نسب الفلورسينس مقابل منحنى مرجعي للحصول على قيم مطلقة. الأهم من ذلك، سيتم إجراء جميع القياسات في الخلايا الحية لتقييم ديناميكي وكمي للبيئة الإنارة من الماكروبينوسومات.
عند اختيار الفلوروفور الحساسة لhh، يجب وزن عدد من الاعتبارات. الأول هو pKa من الفلوروفور ، مما يشير إلى نطاق قيم الحموضة التي سيكون فيها المسبار أكثر حساسية. إذا كان من المفترض أنه بعد وقت قصير من تشكيل، فإن الرقم الحموضة لل macropinosome تكون قريبة من أن من المتوسط خارج الخلية (~ الرقم الحموضة 7.2) وأنه سيتم تحمض تدريجيا من خلال التفاعلات مع endosomes في وقت متأخر والليسوسومات (~ الرقم الحموضة 5.0)، ثم التحقيق مع pK A التي هيحساسة داخل هذا النطاق(الشكل 2C)ينبغي اختيار. وفلورسين الفلوروفور، الذي يحتوي على pKa من 6.4، حساسة على النحو الأمثل داخل هذا النطاق. وقد استخدم على نطاق واسع لقياس العضيات الأخرى المماثلة، مثل الفياغوسومات، وسوف يكون الفلوروفور المفضل في هذه المخطوطة22،25. كمرجع الفلوروفوري، سيتم استخدام رباعي ميثيل هودامين، وهو غير حساس لhh (الشكل 1E). ويمكن استبدال الفلوروفوريس الأخرى، مثل بهرودو وسيبر5e بالفلورسين حيث تتطابق الخصائص الطيفية للفلورسين مع متغيرات تجريبية أخرى. تظهر بعض الفلوروفوريس المرجعية المقترحة ل pHrodo و cypHer5e في الشكل 1.
والاعتبار الثاني هو الطريقة التي سيتم بها استهداف الفلوروفوريسين خصيصا للماكروبينوسومات. Dextran من حجم 70 كيلودا، التي لديها دائرة نصف قطرها الهيدروديناميكية من حوالي 7 نانومتر، لا عصا غير محددة للخلايا ويتم دمجها في macropinosomes، ولكن ليس حفر المغلفة بالكراثرين أو caveolae، وبالتالي علامات macropinosomes (الشكل 2A والشكل 3A،B)16،24،26. في هذا البروتوكول، سيتم استخدام 70 kDa dextran و tetramethylrhodamine (TMR) المسمى 70 kDa dextran كمسبارات حساسة لhh ومرجعية، على التوالي.
في الخلايا المناعية الفطرية ، يمثل داء الكلى والفوستات الطريقين الرئيسيين لعملية استيعاب المواد الخارجية للمعالجة والعرض اللاحق لخلايا الاستجابة المناعية التكيفية27. إن التحكم الدقيق والمنسق في كيمياء الأكسدة لتجويف الفاغوسومات والماكروبينوسومات أمر بالغ الأهمية لمعالجة المواد الخارجية المنشأ الخاصة بالسياق. ولعل المنظم الأكثر دراسة جيدة للأحداث التأكسدية في phagosomes هو NADPH oxidase، وهو مجمع كبير متعدد الوحدات الفرعية التي تنتج كميات كبيرة من أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) داخل تجويف phagosomes28. في الواقع ، نشاطها مركزي لمعالجة المستضد المناسب داخل الفسطومات29،30. ومع ذلك ، لم يتم استكشاف نشاط NADPH oxidase على الأغشية الضامة.
في هذا البروتوكول، يستخدم إستر Succinimidyl H2DCFDA لقياس الأحداث التأكسدية داخل الماكروبينوسوم. هذا هو شكل معدل من الفلورسين (2’،7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate)، وهو الفلورسنت الحد الأدنى في شكله المنخفض. عند الأكسدة ، تزداد انبعاثاتها الفلورية بشكل كبير. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى تحذير كبير من H2DCFDA – حيث أنه يستند إلى فلوريسين الفلوروفور ، كما يتم إخماد مضانه في مقصورات حمضية ، ويجب الحرص على التحكم في هذا المتغير عند تصميم التجارب28. على غرار نهج لقياس الرقم الحموضة، سيتم إرفاق استر Succinimidyl H2DCFDA بشكل مشترك إلى 70 kDa dextran وسيتم استخدام 70 kDa dextran المسمى TMR كفلوروفور مرجعي(الشكل 3A).
سيتم استخدام الفلورسنت ovalbumin لقياس تدهور البروتين داخل الماكروبينوسومات. وصفت ovalbumin المستخدمة هنا بكثافة مع 4،4-difluoro-4-بورا-3a،4a-ديازا-s-indacene (BODIPY) FL صبغة التي يتم إخماد الذاتي. عند الهضم ، يتم تحرير الببتيدات الفلورية ذات العلامات الصبغية القوية. كما ovalbumin لا يمكن أن يكون بسهولة اقترانها إلى 70 kDa dextran، سيتم احتضان الخلايا مع TMR المسمى 70 kDa dextran والبيضاويبومين مرحلة السوائل. سيتم استخدام إشارة TMR لتوليد قناع ماكروبينوسوم أثناء تحليل ما بعد التصوير ، وسيتم قياس الإشارة المحررة من ovalbumin المهضوم داخل القناع(الشكل 3B).
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من وجود عدد من البروتوكولات لكل من القياسات منخفضة وعالية الإنتاجية لامتصاص الماكروبينوسيتيك في الضامة والخلايا الليفية وحتى Dictyostelium spp. 3،7،31،32،33، بذلت محاولات قليلة جدا لقياس الكيمي…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر جامعة كالغاري على دعمها. كما نود أن نشكر الدكتور روبن ييتس على الوصول إلى الكواشف والمعدات والمناقشات المفيدة.
Materials
| Black-walled 96 well plate | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dextran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbumin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Confocal Microscope | Leica | – | |
| TRITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-Dish | Ibidi | 81156 |
Referências
- Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766 (2017).
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
- Ganot, P., et al. Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans. eLife. 50022, (2020).
- Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180 (2020).
- Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
- Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
- Lee, S. -. W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
- Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
- Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
- Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112 (2020).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, 185-199 (2017).
- Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, 227-239 (2017).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
- Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
- Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts. Bio-Protocol. 9, (2019).
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).
- Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).
- Swanson, J. A., King, J. S. The breadth of macropinocytosis research. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).
