وضع العلامات على الحويصلات خارج الخلية لرصد الهجرة والإقبال في الغضاريف Explants
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لتسمية الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الصفائح الدموية لرصد هجرتها وامتصاصها في النباتات الخارجية الغضاريف المستخدمة كنموذج لهشاشة العظام.
Abstract
تستخدم الحويصلات خارج الخلية (EVs) في دراسات مختلفة لإثبات إمكاناتها كعلاج خال من الخلايا بسبب حمولتها المستمدة من مصدرها الخلوي ، مثل lysate الصفائح الدموية (PL). عند استخدامها كعلاج، من المتوقع أن تدخل المركبات الكهربائية الخلايا المستهدفة وتؤثر على استجابة من هذه. في هذا البحث، تمت دراسة المركبات الكهربائية المشتقة من PL كعلاج خال من الخلايا لهشاشة العظام (OA). وهكذا، تم إعداد طريقة لتسمية المركبات الكهربائية واختبار امتصاصها على النباتات الغضاريف. وصفت المركبات الكهربائية المشتقة PL مع صبغة الدهون PKH26، وغسلها مرتين من خلال عمود، ومن ثم اختبارها في نموذج الزراعة العضوية في المختبر يحركها الالتهاب لمدة 5 ساعة بعد تحديد كمية الجسيمات عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA). كل ساعة، يتم إصلاح النباتات الغضاريف، paraffined، مقطعة إلى أقسام 6 ميكرومتر لتركيب على الشرائح، ولاحظ تحت المجهر confocal. وهذا يسمح بالتحقق مما إذا كانت المركبات الكهربائية تدخل الخلايا المستهدفة (chondrocytes) خلال هذه الفترة وتحلل تأثيرها المباشر.
Introduction
هشاشة العظام (OA) هو مرض تنكسي مفصلي ينطوي على التهاب تدريجي ولا رجعة فيه وتدمير المصفوفة خارج الخلية للغضاريف المفصلية1. على الرغم من أن أشكال مختلفة من التهاب المفاصل لديها العديد من العلاجات2,3,4, هذه مقيدة بآثارها الجانبية وفعالية محدودة. تقنيات هندسة الأنسجة باستخدام زرع chondrocyte الذاتية يتم تطبيقها بشكل روتيني للعلاج التجديدي للغضاريف المصابة في آفات غضروف الزراعة العضوية في وقت مبكر4. تقتصر العلاجات المستندة إلى الخلايا بشكل رئيسي بسبب العدد المحدود من الخلايا الشوندروجينية المستقرة أو المتجانسات القادرة على إصلاح الغضاريف3بشكل فعال. لذلك ، فإن وضع استراتيجيات علاجية جديدة لمنع تطور المرض وتجديد آفات الغضاريف الكبيرة له أهمية قصوى.
الحويصلات خارج الخلية (EVs) وقد اقترح كعلاج لOA من قبل مؤلفين مختلفين5,6. المركبات الكهربائية هي أجسام ممبرانية تفرزها غالبية أنواع الخلايا ، وتشارك في الإشارات بين الخلايا ، وقد ثبت أنها تمارس الآثار العلاجية للخلايا الجذعية7،8،9، والتي أثارت مؤخرا اهتماما بالطب التجديدي10. المركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا النجمية المتوسطة (MSCs) هي المركبات الكهربائية العلاجية الرئيسية التي تم التحقيق فيها ل OA ، على الرغم من استخدام الخلايا الأخرى ذات الصلة بالمفاصل كمصادر EV ، على سبيل المثال ، chondroprogenitors أو الخلايا المناعية11،12.
وتستخدم تركيزات الصفائح الدموية، مثل lysates الصفائح الدموية (PLs)، لتعزيز التئام الجروح في إصابات مختلفة، مثل قرحة القرنية13،14،15 أو في تجديد أنسجة الأوتار16،بسبب فرضية أن مكون EV من مركزات الصفائح الدموية قد تكون مسؤولة عن هذه الآثار17 . تستخدم بعض الدراسات المتعلقة بالأمراض المرتبطة بالمفاصل المركبات الكهربائية المشتقة من الصفائح الدموية (PL-EVs) كعلاج لتحسين حالات هشاشة العظام. PL-EVs تحسين انتشار chondrocyte وهجرة الخلايا عن طريق تفعيل Wnt / β-catenin المسار18, تعزيز التعبير عن علامات الشوندروجيني في chondrocytes هشاشة العظام19, أو تظهر مستويات أعلى من البروتينات الشوندروجينية وتشوهات أقل تيسي في الأرانب هشاشة العظام تعامل مع PL-EVs18.
تحتوي المركبات الكهربائية على البروتينات والدهون والأحماض النووية التي يتم تحريرها إلى الخلية المستهدفة ، مما يؤسس للاتصال من خلية إلى خلية ، وهي الميزة الرئيسية المتعلقة بتطبيقاتها العلاجية20. تعتمد آثار المركبات الكهربائية على وصولها إلى الخلايا وإطلاق الشحنات اللاحقة. يمكن تأكيد هذا التأثير بشكل غير مباشر من خلال التغيرات التي تحدث في الخلايا، مثل النشاط الأيضي أو تعديل التعبير الجيني. ومع ذلك، لا تسمح هذه الطرق تصور كيفية وصول المركبات الكهربائية إلى الخلايا لممارسة وظيفتها. وهكذا، تقدم هذه الورقة طريقة لتسمية هذه المركبات الكهربائية المشتقة من PL لاستخدامها كعلاج لنباتات غضروف الزراعة العضوية التي يحركها الالتهاب. تم استخدام المجهر Confocal لرصد امتصاص EV والتقدم إلى chondrocytes موجودة في explants في الفاصل الزمني من 5 ساعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يساعد التصوير EV على فهم خصائص EV، مثل آليات إطلاقها واستيعابها. يسمح تصويرهم بمراقبة التوزيع الحيوي وتوصيف خصائصهم الدوائية كمركبات دوائية. ومع ذلك، قد يكون التصوير EV وتتبع صعبة نظرا لأحجامها الصغيرة، على الرغم من أن العديد من أجهزة التصوير وتقنيات وضع العلامات قد وضعت لمساعدة الباحثين م?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد مول هذا البحث معهد سالود كارلوس الثالث، الوزير الاقتصادي، الذي شارك في تمويله الصندوق الاجتماعي الأوروبي وصندوق التنمية الإقليمية الأوروبي التابع للصندوق الأوروبي للتنمية الاقتصادية (MS16/00124؛ CP16/00124); بواسطة PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS، construyendo SALUD، جينيراندو فالور (JUNIOR01/18)، بتمويل من ضريبة السياحة المستدامة لجزر البليار؛ من قبل Direcció العام d’Investigació، كونسيليريا دي إنفيستيغاسيو، الحكم بالار (FPI/2046/2017)؛ من برنامج FOLIUM ما بعد الدكتوراه (FOLIUM 17/01) ضمن FUTURMed ، الممول بنسبة 50٪ من ضريبة السياحة المستدامة لجزر البليار و 50٪ من قبل ESF ؛ ومن قبل لجنة دوسينسيا إي إنفيستياسيو دي لا فونداسيو بانك دي سانغ إي تيكسيتس دي ليه إيلي بالار (CDI21/03).
Materials
| Material | |||
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
| Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
| Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
| Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
| Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
| Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
| TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |
Referências
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, &. #. 3. 2. 1. ;., Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
- Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Burke, J., et al. et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
- Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
- Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
- Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- D’Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).
- Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
- El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
- Yuta, K., et al. Graefe’s archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
- Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31, 289-292 (2007).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
- Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).
- Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).
- Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
- Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).
- de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
- Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
- Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
- Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
- Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021)
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
- Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).
